单链抗体对猪流行性腹泻病毒感染仔猪腹泻保护作用初步研究

张凡庆 ，陈玉雪 ，杨 亮 ，朱建国

（1.上海交通大学农业与生物学院 上海 200240； 2.上海市兽医生物技术重点实验室，上海 200240； 3.上海富朗特动物保健股份有限公司，上海201502）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED） 是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemi c diarrhea virus，PEDV）感染引起的一种高度接触性肠道传染病。发病猪表现为水泄、呕吐、脱水，甚至死亡［1］。各年龄段的猪都可以被感染，仔猪感染后症状最为严重，发病率和死亡率达到100%。PED最早在1971年英国的伦敦发生，之后在1978年才分离到第1株PEDV。我国在20世纪80年代首次出现了PED病情报道。该病在2010年以前为散发，没有受到重视。2010年秋季以后，该病突然在我国出现了暴发，造成大量仔猪死亡，许多猪场甚至出现了没有仔猪可养的状态，造成了巨大的经济损失。2013年该病又传播至美国，对美国养猪业造成了沉重的影响［2，3］。

PEDV属于冠状病毒科（Coronaviridae）， 冠 状 病 毒 属（Conronavirus）。病毒粒子呈圆形或椭圆形，具有囊膜，囊膜表面具有纤突。PEDV的基因组为28 000 nt，是目前已知的最大的动物RNA病毒。PEDV基因组具有7个开放阅读框（open reading frames，ORFs）， 编 码四个结构蛋白和三个非结构蛋白，四个结构蛋白分别是纤突蛋白（Spike，S）、小膜蛋白（Envelope，E）、囊膜蛋白（Membrane，M）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）［4］。这些病毒蛋白在PEDV的黏附、入侵、复制、组装、出芽和免疫逃避中发挥了重要的作用。

单链抗体（single chain fragment variable， scFv）是一种基因工程抗体，它是将抗体的重链可变区和轻链可变区通过一个短的柔性肽段连接而成［5］。scFv保留了抗原结合活性，分子量仅为完整抗体分子的1/6。由于scFv只有抗体的Fc片段，避免了使用过程中的种属问题。目前通常使用噬菌体单链抗体展示技术筛选抗体，该方法将编码的scFv通过基因工程的方法与噬菌体外壳蛋白基因偶联，使scFv被外壳蛋白携带并展示在噬菌体的表面，然后通过筛选富集方法获得具有亲和力和特异性的重组噬菌体。

本研究对实验室保存的一株抗PEDV的scFv的生物学特性进行了鉴定，并且在仔猪上研究了该scFv对PEDV的免疫保护效果，本研究对临床预防和治疗PEDV提供了一个思路。

1 材料与方法

1.1 毒株与细胞

PEDV上海崇明分离株由本实验室保存。非洲绿猴肾（Vero）细胞由本实验室保存。

1.2 主要试剂

Ni-NTA His标签纯化试剂盒购自美国Merck公司；DMEM高糖培养基、胰酶、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；FITC标记小鼠抗His标签抗体、抗His标签小鼠单克隆抗体、HRP标记羊抗小鼠二抗购自Abcam公司；低熔点琼脂糖购自Thermo公司；TPCK处理的胰酶购自上海生工生物公司。

2 方法

2.1 scFv的纯化

从-40 ℃冰柜中取出冻存的抗PEDV scFv 菌株（scFv 与 pET-28a（＋）载体连接），在2 × YT-K固体培养基上划线。第2天挑取单个菌落至液体培养基中培养。使用Ni-NTA His标签纯化试剂盒进行纯化， Elute buffer洗脱蛋白。取少量纯化后的蛋白进行SDSPAGE分析。

2.2 scFv的特异性分析

取出实验室保存的PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、圆环病毒2型（PCV2）、产肠毒素大肠杆菌K88和K99菌株，37 ℃包被96孔ELISA板。接着向每孔中加入纯化的单链抗体 100 μL（10 μg/mL）， 孵 育 后 加入鼠抗His标签一抗、PBST洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠二抗。最后加入TMB显色液，在酶标仪OD450nm处读取数值。

2.3 scFv的免疫荧光实验

将 1.2 ×105TCID50/mL 的 TGEV感染六孔板中的ST细胞，在无血清培养基中培养48 h。将ST细胞用4%多聚甲醛固定。依次加入scFv和FITC标记的抗His标签二抗，在荧光显微镜下观察结果。

2.4 scFv对仔猪腹泻的保护实验

取6头21日龄长白仔猪，按以下处理分组。第1组1头猪，为病毒处理组，先灌胃15 mL PBS，1 h后攻入2×106TCID50/mL的PEDV；第2组3头猪，为scFv预防组，先灌胃15 mL浓 度 为 400 μg/mL的 scFv，1 h后攻入2×106TCID50/mL的PEDV；第3组1头猪，用来评价scFv的生物安全性，先灌胃15 mL浓度为400 μg/mL的scFv，1 h后加入15 mL PBS；第4组1头猪，为阴性处理组，先灌胃15 mL PBS，1 h后再灌为 15 mL PBS。

在实验的第2、4、7天观察仔猪发病情况，记录精神状态、腹泻情况和死亡数量。

分别采集发病死亡的猪以及第7天处死猪的小肠，用生理盐水清洗内容物后，取2～3 cm长的小肠组织置于10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋后制作切片，HE染色后，在光学显微镜下观察其病理学变化。

2.5 scFv对仔猪的生物安全性评价

分别在感染后第2、4、7天采集仔猪粪便5 g，加入少量PBS后离心，取上清液。ELISA包被PEDV全病毒抗原2 μg/mL，包被封闭后加入提取的粪便上清液，检测粪便中scFv的含量。

3 结果

3.1 抗猪流行性腹泻病毒scFv的纯化

将复苏的菌株接种至含有50 μg/mL卡那霉素的2×YT培养基中，37 ℃培养至OD600达到0.5时加入50 mmol的IPTG，30 ℃培养过夜。第2天收集离心的沉淀。使用超声破碎仪破碎后，上清液加入Ni-NTA his标签蛋白纯化树脂，纯化蛋白。10% SDSPAGE电泳结果显示在28 ku有特异性条带，证实scFv被成功纯化（见图1）。

图1 scFv的SDS-PAGE电泳

3.2 scFv的免疫荧光实验

将1 MOI 的PEDV感染Vero细胞，24 h后加入4%多聚甲醛固定，接着加入封闭液和透化液，30 min后加入scFv，接着加入抗His标签的荧光二抗，结果显示scFv加入后细胞出现绿色荧光，阴性对照组没有出现荧光（图2）。

图2 scFv的免疫荧光实验

3.3 scFv的仔猪保护实验

将6头仔猪分为攻毒组，scFv免疫组、scFv对照组和阴性对照组。在感染后第2、4、7 天观察临床症状，结果见表1。从表1可以看出，PEDV攻毒组在攻毒后出现腹泻，症状逐渐加重，并且食欲减少。scFv免疫组处理后，腹泻症状显著减轻，并且食欲正常。scFv对照组证实scFv使用不会引起仔猪腹泻。此外，所有组没有出现仔猪的死亡。

表1 仔猪发病情况

图3 HE染色切片

第7天剖检仔猪，可见PEDV攻毒组仔猪肠道充满内容物和气体，肠壁变薄。scFv免疫组仔猪肠道眼观没有变化。采集仔猪的小肠，石蜡包埋后染色。结果发现PEDV攻毒组的仔猪小肠绒毛上皮脱落，有炎性细胞浸润。scFv＋PEDV、scFv和阴性对照组则没有出现肠道损伤，说明scFv处理能够对仔猪感染PEDV产生保护(见图3)。

3.4 scFv的生物安全性评价

分别在感染后第2、4、7天采集仔猪粪便加入少量PBS悬浮，将离心的上清液进行ELISA检测。结果表明单链抗体处理的仔猪粪便中未检测到scFv，说明制备的scFv具有生物安全性（见图4）。

图4 scFv的生物安全性评价

4 讨论

PEDV属于冠状病毒科，感染各年龄段仔猪，临床症状表现为呕吐、腹泻和脱水。在2010年以前PEDV的预防以疫苗免疫为主，并取得了很好的效果。然而当2010年的秋季疫情暴发后，传统疫苗效果不佳，大量仔猪发病死亡［6］。之后的测序发现2010年流行株的基因发生了变异，传统的疫苗不能提供保护，因此迫切需要针对新型流行株的免疫/治疗制剂。本研究的单链抗体针对流行性PEDV毒株，因此具有很好的临床应用价值。

scFv具有特异性好，分子量低，能够进行改造等特点。目前scFv广泛应用于肿瘤、病原菌、毒素的诊断和治疗。之前一些文献报道了scFv对病毒也有抑制和治疗作用。本文将实验室获得的scFv进行鉴定，证实该scFv具有中和病毒的效果。动物保护实验证明，预先给仔猪口服scFv制剂后能够阻断病毒的入侵。本研究为scFv的推广应用奠定了基础。