第26届国际生物学奥林匹克竞赛试题实验2·分子生物学

王戎疆 张 立 佟向军范六民 刘宝玉

（1北京大学生命科学学院 北京 100871 2北京师范大学生命科学学院 北京 100875 3天津市第一中学 天津 300051）

总分：100分

考试时间：90 min

共15题

本考题由3部分组成。

第1部分：质粒的限制酶图（48分）；

第2部分：基于PCR的酵母突变体基因分型（37分）；

第3部分：突变酵母的氨基酸营养缺陷（15分)。

任务1：

1）检查材料和设备。

2）选择限制酶。

3）孵育酶切反应。

4）配制琼脂糖凝胶。

5）准备样品并加载凝胶。

6）凝胶电泳*。

任务2：

7）拍摄凝胶照片及回答问题。

8）设置PCR反应。

9）PCR反应。

10）准备样品并加载凝胶。

11）凝胶电泳*。

任务3：

12）拍摄凝胶照片及回答问题。

13）观察和推论。

*注意：在操作时使用同一块凝胶上不同的样品孔。

材料和设备

现代生物技术作为21世纪的主要技术之一，它产生于食品研究，同时又很快被应用于食品生产。对于解决国家粮食危机，转基因产品举足轻重。但随着转基因产品对人们日常生活的影响不断扩大，其安全性遭到质疑。如何应对转基因产品，成了政府迫切需要解决的问题。目前，全球各国都在寻求一条有效途径，来平衡两者的冲突。如何用法律制度对其进行规制，已成为人类目前面临的重要问题之一。

为了完成实验工作，你需要下面列出的材料。请确保可以获取这些材料。每位考生只有一份实验材料，在考试过程中请谨慎操作。

请注意：1）为了完成分析，实验中提供的所有液体试剂都超过了所需用量的2倍。在实验过程中出现溢出或错误时，不提供附加材料（包括实验器材和琼脂糖凝胶）。2）为了在管底收集液体，请使用手册中注明的技术。3）考试的目的之一是测试你的实验工作技能。4）标签上标有蓝线的试管应一直保存在冰上。5）所有溶液都处于冷冻状态，所以你必须在使用前对其进行解冻和混匀。

材料编号 数量 材料 在本试卷中需要使用的部分A 1 微量移液管 1～10 μL 1，2 B 1 微量移液管 20～200 μL 1，2 C 1 盒移液枪白枪头 1～10 μL 1，2 D 1 盒移液枪黄枪头 20～200 μL 1，2 E 1 PCR管架 1，2 F 1 1.5 mL 管架 1，2 G 5 1.5 mL管（有管盖）2 H 2 0.2 mL PCR管（有管盖，不要将管和盖分开）1，2 I 1 12孔琼脂糖凝胶（请勿打开包装，直到你准备加载凝胶）1，2 J 1 OneRun电泳系统；缓冲液 1，2 K 1 记号笔 1，2 L 1 秒表／定时器 1，2 M 1 纸巾 1，2 N 1 一套塑料手套（在候考时发放）1，2 O 2 拉锁袋（信封）1，2 P 1 含有8种不同培养基上生长的酵母照片的手册 3 Q 1 用于生成各种氨基酸的生化反应图（在工作区的墙上）3 R 1 1 Kb Plus DNA marker 1，2 S 1 联系考务人员时所需的粉红卡片 1，2，3 T 2 小型标签 1，2 U 1 大标签 1 V 1 540 μL 水 1，2

材料H：具有国家代码和学生编号的ID标签和试管

冰桶含有1.5 mL管和一套液体。

液体编号 数量 标签 体积（μL）成分1 1 dNTP 60 dATP、dGTP、dcTP和dTTP 混合物2 1 DNApol缓冲液 140 DNA聚合酶缓冲液（5×）3 1 上样缓冲液 100 加载缓冲液，用于琼脂糖凝胶电泳4 1 引物A 30 引物对A 5 1 引物B 30 引物对B 6 1 引物C 30 引物对C 7 1 引物D 30 引物对D 8 1 引物E 30 引物对E 9 1 DNApol 14 脱氧核糖核酸聚合酶10 1 1 Kb marker 12 DNA marker，用于琼脂糖凝胶电泳11 1 缓冲液1 8 缓冲液1（10×）12 1 缓冲液2 8 缓冲液2（10×）13 1 缓冲液3 8 缓冲液3（10×）14 1 模板WT 6 野生型模板DNA 15 1 突变体模板 6 突变体模板DNA 16 1 质粒1 6 质粒1 17 1 质粒2 6 质粒2 18 1 ApaI 6 ApaI限制酶19 1 EcoRI 6 EcoRI限制酶20 1 SmaI 6 SmaI限制酶

1 限制酶选择（48分）

设计一个实验以确定酿酒酵母中蛋白质Alb的亚细胞定位。实验策略要求将基因alb（999bp）与编码2种不同荧光蛋白的序列融合。这是通过将基因克隆到2个质粒骨架（pX和pZ）中实现的，最终可得到质粒pX：alb和pZ：alb。用2个连接混合物转化大肠杆菌。纯化来自2个大肠杆菌转化体的质粒，得到“质粒管1”和“质粒管2”中的DNA。请确定2个管中包含有4个可能质粒（pX，pX：alb，pZ或pZ：alb）中的哪2个（每个管中1个）。

问题1.DNA片段大小。（2分）

用标签表示4种质粒完全酶切获得的DNA片段的预期大小。

限制酶及其最佳反应条件表

对2个质粒进行严格的限制性内切酶设计。

问题2.选择限制性内切酶。（4分）

你有3种限制酶可用：ApaI、EcoRI和SmaI。点击这3种酶中的一种，可以区分4种可能的质粒。请注意，长度小于100 bp的DNA片段将产生非常微弱的条带，并且不能准确地确定它们的大小。

A.ApaI B.EcoRI C.SmaI

问题3.设计研究方案。（4分）

步骤：

1）分别用S1、S2、S3和S4标记0.2 mL PCR管。

2）设计酶切实验，以确保使用所有2种质粒，其中包含未切割质粒DNA的对照。每个反应的总体积应为10 μL。典型的限制酶酶切包括：2 μL质粒DNA，1 μL限制酶，1 μL缓冲液和加水至终体积为10 μL。

用整数表示添加到4个管中的每一种液体体积（所有量都以μL计）。如果不添加此特定成分，请写入“0”。

S1（μL）S2（μL）（对照）S3（μL）S4（μL）（对照）质粒管1质粒管2 ApaI EcoRI SmaI 10 x缓冲液1 10 x缓冲液2 10 x缓冲液3水总容积

问题4.酶切的反应条件。（2分）

继续步骤：

3）按照问题2中的说明，混合限制性酶切反应的必要组分。

4）将移液器的体积设置为5 μL，并通过在每个管中上下吸打5～10次进行充分混合。始终保持移液管尖端在液体表面以下，避免产生气泡。

5）将0.2 mL管放在小的拉链锁袋中。关闭袋子，并将标签上的ID号贴在包装袋外面。

请指出你用于酶切的反应条件：

A.25℃ B.37℃

继续步骤：

6）举起你的粉红色卡片与考务人员联系，考务人员会将你的样品送到所选的培养箱。完全酶切质粒DNA需要15 min的孵育。

7）20 min后，你的粉红色卡片会提示你收回样品。

8）请检查你是否收到了自己的样品。

9）向每个样品中加入3 μL加样缓冲液。

10）通过上下吸打10次混合（避免产生气泡）。

使用标准琼脂糖凝胶电泳方法，通过凝胶电泳分析限制酶酶切的效果。

警告：电气危险-RunOne电泳仪一旦启动就不要移动。开始时，请勿将物品穿过设备盖子的薄片加入。

警告：潜在的危险化学物质。当处理琼脂糖凝胶时，始终佩戴手套，因为它是与DNA结合染料一起预染的。

建议的操作流程：通过琼脂糖凝胶电泳分析第1部分和/或第2部分的样品。a.加载第1部分的样品并运行15～20 min。b.停止设备。c.加载第2部分样品。d.重新启动设备，再运行15～20 min。

电泳方案：1）戴橡胶手套。2）将RunOne电泳室的盖子抬起直立。3）从白色袋子包取出琼脂糖凝胶准备进行电泳。拆下透明盖子，并将凝胶从透明外壳小心地提起。小心处理凝胶，因为它容易断裂。保留白色袋子供以后使用。4）检查凝胶是否存在明显的损坏，如裂缝/缺少孔或凝胶内部有气泡等。如果你发现此类问题，请立即通过举起粉红色卡片向考务人员报告。5）如下图所示放置凝胶。

继续操作步骤：

7）凝胶应完全浸没在缓冲液中。如果不能，请考务人员提供适当的帮助。

8）如下2个表（第1部分的样品、第2部分的样品)所述装载琼脂糖凝胶。加载3 μL 1 Kb marker、13 μL样品（第1部分）和15 μL（第2部分）。

第1部分（1～5孔）

第2部分（6～12孔）

继续电泳步骤：

9）将盖子放在RunOne装置上（有标签的一面向下滑入电源盒）。

10）检查电压是否设置为100 V，否则使用“电压选择”按钮。

11）按“运行/停止”按钮打开电源，运行凝胶电泳15～20 min。请注意，你将无法看到通过凝胶实时迁移的DNA带，但缓冲液中的蓝色指示剂与300 bp DNA片段的迁移速度相同。

12）20 min后，按“运行/停止”按钮关闭电源。

13）举起你的卡片，考务人员将带给你在琼脂糖凝胶上查看DNA所需的设备，并记录下来。

14）通过使用你的平板电脑和考务人员为你带来的设备，将凝胶中的DNA带记录下来。考务人员将协助你进行记录。

15）将托盘中的琼脂糖凝胶转移到灯台上。

16）将黑色照片罩放在灯台的顶部。

17）将平板电脑放在照相机的顶部，使透镜向下指向室内。

18）拍摄你的凝胶图片。

问题5.拍照记录你的DNA电泳结果。

拍摄DNA凝胶的3张照片。这些图像将用于判断你的PCR和限制酶酶切反应是否成功。

上传你的3张凝胶图像。

完成拍照，请将凝胶转移到交付的白色袋子里。

问题6.使用限制酶酶切质粒DNA。

在下图中指出质粒DNA是否已被添加的限制酶酶切。

现在请根据提供的标准凝胶图片，对照你选择的限制酶获得的结果（问题3）。使用这张照片回答问题7和8。请注意，你只有在完成凝胶记录后才可以使用标准图片。

问题7.限制酶酶切的DNA片段大小。

如果在限制酶酶切中存在给定大小的DNA片段，则用标签表示出来。

问题8.每管中质粒的鉴定。

指示出每个管中存在哪些质粒，不存在哪些质粒。如果不能确定管中的质粒存在与否，则在最后一列中用“+”表示。

2 基于PCR的基因组遗传检测（37分）

前期工作中已经分离出突变体酵母菌株。这种酵母菌株在生长培养基中需要酪氨酸和苯丙氨酸才能繁殖。突变体在没有色氨酸的培养基上生长的能力尚未测试。突变菌株的回交显示仅单个基因受到了影响。你的任务是确定观察到的营养缺陷的遗传基础。你可以使用5个引物对（下表）,每个引物对能检测编码芳香族氨基酸生物合成途径中5种关键酶的基因的功能障碍（突变体）等位基因（下图）。

可用的引物对及它们扩增的基因预期的DNA片段大小

用于形成芳香族氨基酸的生物合成途径（左上：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，假苯甲酸酯，分支酸盐和莽草酸酯）及编码途径中各个酶的基因

问题9.选择引物对。（5分）

通过结合5个引物对中2对可用引物（上表）的结果，可以确定在突变酵母菌株中观察到的营养需求的遗传基础。

在下图中指出选用的2个引物对（上表中A，B，C，D或E的组合）

步骤：

1）在1.5 mL管中制备PCR反应的混合物：196 μL水+70 μL DNA聚合酶缓冲液（5×）+35 μL dNTP+7 μL DNA聚合酶。

2）将移液管设置为100 μL，上下吹打5～10次。

3）找到0.2 mL PCR管标签条，并粘贴在一个带有ID号的小标签上。

4）标记管1～6（不要将管条分离，否则你的样品将不能参加PCR反应）。

5）将44 μL混合物平均转移至6个PCR管中的每一个中。

6）对于管1～3，加入5 μL你选择的第1个引物对。

7）对于管4～6，加入5 μL你选择的第2个引物对。

8）向管1和4加入1 μL野生型模板DNA。

9）对于管2和5，加入1 μL突变体模板DNA。

10）对于管3和6，加入1 μL水。

11）在PCR程序中将移液管设定为45 μL，上下移动5～10次混合各个反应。关闭盖子。

3个PCR程序（1～3）（结束后存储在10°C）

问题10.选择PCR程序。（2分）

请指出，如果引物溶解温度（Tm）为60℃，DNA聚合酶可以以72 bp/s的速度在72℃下合成DNA，则3种PCR程序中哪一种（上表）能够成功应用于扩增？

A.PCR程序1 B.PCR程序2 C.PCR程序3

重要提示：

1）请确保你按照步骤回答问题9和10。一旦你对答案表示确定，请点击“LOCK ANSWERS”锁定。注意：锁定后，将无法再更改答案。

2）一旦你的答案被锁定，请举起卡片，考务人员将把你的样品转移到PCR仪。PCR程序需要20 min左右才能完成（此时可转到第1部分或第3部分）。

3）20 min后,你的卡片将会提示送回你的样品。

4）收到样品后，请检查它们是否为你的样品。

5）准备将PCR样品进行琼脂糖凝胶电泳，每个样品中加入10 μL加样缓冲液，并通过上下吹打5次混合均匀（避免产生气泡）。

6）按照琼脂糖凝胶电泳部分所述方法装载样品。

7）通过拍摄照片记录凝胶（该凝胶的照片将被评估，最多可以获得22分）。你现在将获得一个标准的凝胶图片，基于你以前选择使用的引物对PCR分析。请使用这些信息回答问题11和12。注意：你只有在得到考务人员发回你的凝胶照片后，才能获得标准的凝胶图片。

问题11.DNA片段大小。（4分）

如果给定大小的所得DNA（bp）产物存在，则请在此处注明“+”，并逐列报告结果。

问题12.功能异常酶的分析。（4分）

根据你的结果，指出每种酶功能状态。

3 突变酵母的氨基酸营养体分析（15分）

多年来，单倍体真菌酿酒酵母（面包酵母）已被用作模拟生物体，用于阐明真核生物中的新陈代谢过程。酵母通常能够合成蛋白质所需的全部20种氨基酸。在经过UV-诱变后，研究人员已经分离出各种氨基酸营养缺陷突变体。下面具有8张照片的手册描绘了在8种不同培养基（A～H）上生长的单倍体酿酒酵母菌株1～5。位置1=无接种物，位置2=菌株1；位置3=菌株2；位置4=菌株3；位置5=菌株4；位置6=菌株5。板A～H的培养基组成在下表中给出。请注意：不要在照片上留下任何注释。

培养基成分

问题13.菌株生长情况分析。（10分）

记录各种菌株的生长或缺乏生长，用“+”表示生长，“-”表示不生长。

问题14.功能缺陷的酶的分析。（5分）

基于记录的生长模式，推导出在5个菌株（1～5）中哪个或哪些最有可能存在功能缺陷的酶（如果有的话）。对于每个突变体，写入功能缺陷酶所在步骤的数字（1～31）（见培养基成分表），如果没有步骤功能失调，则填0。

考试结束。

（待续）