旋覆花总黄酮的降脂作用研究△

杨振，何丽明，倪赛宏，傅水莲，邹丽园，洪铁*

(1.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2.吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012；3.吉林大学 药学院 药理教研室，吉林 长春 031021，4.吉林大学 中日联谊医院，吉林 长春 130033)

我国心脑血管疾病发病率逐年升高且日益年轻化。目前，心脑血管疾病已成为危害人群健康最严重的疾病[1]。流行病学研究显示，我国约有2.9亿人患心血管疾病，每小时约300人死于心脑血管疾病。高脂血症作为心血管疾病的重要危险因素之一，其在动脉粥样硬化和脑血管病的发生和发展中发挥着重要作用。预防和治疗高脂血症是防治心脑血管疾病的重要途径[2]。目前，临床上使用的降血脂药物包括：用于促进胆酸或胆固醇排泄、促进胆固醇的降解、抑制胆酸和胆固醇吸收的胆酸螯合剂，如考来替泊、考来烯胺等；抑制胆固醇合成关键酶羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的HMG-CoA还原酶抑制剂类，如洛伐他汀、普伐他汀等；抑制cAMP的形成、导致甘油三酯酶活性降低、进而降低血液中甘油三酯浓度的烟酸及其衍生物，如阿西莫司、烟酸肌醇酯等。上述药物虽能够达到降血脂的作用，但长期服用均出现较严重的不良反应，因此，寻求疗效显著、安全可靠的调血脂的药物得到广泛关注[3-5]。

旋覆花是一种传统的中草药，为菊科旋覆花属植物欧亚旋覆花的干燥头状花絮，主要分布于中国、韩国和日本，中国主要产于河南、河北、江苏、浙江、新疆、东北等地[6]。该药收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部，味咸、性温，入肺、肾经，主治咳嗽消炎等。目前，已报道的旋覆花的化学成分约有40多种，主要含有甾醇、倍半萜、香豆素及黄酮类化合物，具有抗炎、抗肝损伤、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性。本研究采用高糖高脂饮食建立高脂血症SD大鼠模型，初步探讨旋覆花总黄酮对高脂血症大鼠的降脂及改善脂肪肝作用[7-8]。

1 材料

1.1 动物

SD大鼠，雄性，150～160 g，SPF级，购于辽宁长生生物制品有限公司，许可证号：SCXK(辽)-2015-0001。动物饲养于吉林省中医药科学院的SPF屏障系统内，室内温度(23±2)℃，相对湿度(50±10)%，昼夜明暗交替时间12/12 h，大鼠自由进食饮水。

1.2 试剂和药品

旋覆花采自吉林省长春市双阳区，标本存放于吉林省中医药科学院长白山资源所(编号：201700902)，经吉林省中医药科学院牛志多研究员鉴定为欧亚旋覆花InulabritannicaThunb.。

总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三脂(TG)试剂盒、总胆汁酸(TBA)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；血清白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；苏木紫(Britain进口分装)；曙红(水溶，天津市大茂化学试剂厂)。

2 方法

2.1 旋覆花总黄酮的制备

取一定量旋覆花浸泡3 h后，过滤，滤渣用乙醇回流提取2次后过滤，合并滤液，浓缩。减压干燥以获得黄酮粗提取物。AB-8大孔树脂纯化欧亚旋覆花总黄酮的工艺条件为：提取物上样浓度为0.2 g·mL-1，以2 mL·min-1的流速缓慢上样，用70%乙醇进行洗脱，洗脱速度为3 mL·min-1，以高效液相法测定黄酮的含量，纯化后总黄酮纯度为86.54%。

2.2 动物分组

大鼠适应性喂养3 d后，将其随机分为对照组，模型组，辛伐他丁阳性药组(3.33 mg·kg-1)，旋覆花总黄酮高剂量组(100 mg·kg-1)、中剂量组(50 mg·kg-1)、低剂量组(25 mg·kg-1)，除空白组饲喂基础饲料外，其余各组大鼠喂食高脂饲料(63.6%维持饲料、20%蔗糖、15%猪油、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠)建造高血脂症模型，连续造模4周。第五周开始，继续给予高糖高脂饲料的同时给予相应剂量的受试物干预，持续8周，每周测定1次体质量，根据体质量调整给药剂量，每日早9时每笼(5只)给予400 g饲料，次日早9时收集饲料，称体质量，计算每只大鼠的日均摄食量。

2.3 血清指标

实验结束时，禁食12 h后，腹腔注射10%水合氯醛使大鼠麻醉，腹主动脉取血，室温静置30 min后，300×g，4 ℃，离心10 min，收集上清液，-80 ℃保存。按照试剂盒操作说明书测定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、MDA、GSH-PX、TNF-α、IL-6、IL-10水平。

2.4 肝脏指标

实验结束后，迅速解剖大鼠，精确称取大鼠相同部位肝脏0.2 g，在冰水中制成10%匀浆，4 ℃ 4000 r·min-1离心10 min，提取上清液，测定其中总胆固醇水平。取0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm块状的肝脏组织用预冷的0.9%氯化钠溶液冲洗后擦干，快速置于中性福尔马林溶液中固定。

2.5 粪便胆汁酸

于大鼠处死前12 h将大鼠分笼饲养，12 h后收集大鼠粪便，粪便经真空冷冻干燥后，用磷钼酸比色法测定粪便中总胆汁酸的含量[9]。

2.6 肝脏病理形态学观察

固定好的肝脏组织块，依次用75%、95%和100%乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，H&E染色，于光学显微镜下病理学观察每组切片中肝脏的脂肪变性、炎症细胞及组织坏死程度。按照如下标准进行评分：+表示肝小叶结构尚存，肝组织结构大致正常，汇管区周围肝细胞肿胀、轻度脂肪变性；++表示肝细胞排列紊乱，大部分肝细胞肿胀、气球样变，汇管区少量炎细胞浸润；+++表示肝小叶结构轮廓消失，肝细胞形态不规则，可见部分肝细胞脂肪变性，也可见部分动物出现肝细胞点状或片状坏死，汇管区炎细胞浸润。

2.7 统计方法

3 结果

3.1 对大鼠体质量及食量的影响

表1结果显示，各剂量组大鼠进食量未存在统计学差异；与对照组相比，高脂血症模型组大鼠体质量增长率显著增加(P<0.05)，连续给予旋覆花总黄酮4周能够显著降低高脂血症模型组大鼠体质量增长率(P<0.05，P<0.01)。

表1 对高血脂症大鼠日均进食量及体质量增长率的影响

注：与对照组相比，##P<0.05；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 对高血脂症大鼠血脂水平的影响

表2结果显示，与对照组相比，高脂血症模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平显著增加，HDL-C水平显著降低(P<0.05)，连续给予旋覆花总黄酮4周能够显著降低高脂血症模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平(P<0.05，P<0.01)。

3.3 对高血脂症大鼠肝脏中胆固醇与粪便中胆汁酸水平的影响

表3结果显示，与对照组相比，高脂血症模型组大鼠肝脏中胆固醇水平显著增加(P<0.05)，连续给予旋覆花总黄酮4周能够显著降低高脂血症模型组大鼠肝脏中胆固醇水平(P<0.01)；与对照组相比，高脂血症模型组大鼠粪便胆汁酸水平显著增加(P<0.05)，连续给予旋覆花总黄酮4周能够显著增加高脂血症模型组大鼠粪便中胆汁酸水平(P<0.05，P<0.01)。

3.4 对高血脂症大鼠肝脏病理形态的影响

形态评分结果见表4，光镜下H&E染色显示，普通饮食组大鼠肝细胞排列整齐，肝小叶规则，细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀(见图1A)。高脂饮食组大鼠肝细胞肿胀，体积较正常明显增大，出现脂肪变性，胞质内可见大小不等的脂滴空泡，以大泡性脂肪滴为主，汇管区有以单核、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，部分出现点状坏死和灶状坏死，大鼠出现散在性肝细胞脂肪变性(见图1B)。给予旋覆花高、中、低剂量及辛伐他丁可改善肝脏的相关病理改变(见图1C、D、E、F)。

3.5 对高血脂症大鼠血清抗氧化活性的影响

表5结果显示，与对照组相比，高脂血症模型组大鼠血清中SOD活性显著降低、MDA水平及GSH-PX活性显著升高(P<0.05)；连续给予旋覆花总黄酮4周能够显著升高高脂血症模型组大鼠血清中SOD活性，降低MDA水平及GSH-PX活性(P<0.05，P<0.01)。

3.6 对高血脂症大鼠血清炎症因子的影响

表6结果显示，与对照组相比，高脂血症模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平显著升高，IL-10水平显著降低(P<0.05)；连续给予旋覆花总黄酮4周能够显著降低高脂血症模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平，升高IL-10水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。

表2 对高脂血症模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影响 mmol·L-1

表3 对高脂血症大鼠肝脏中胆固醇及粪便中胆汁酸水平的影响

表4 对模型组大鼠肝脏病理形态的影响

注：A.普通饮食组；B.高脂饮食组；C.高脂饮食+辛伐他丁组；D.高脂饮食+旋覆花低剂量组；E.高脂饮食+旋覆花中剂量组；F.高脂饮食+旋覆花高剂量组。图1 各组大鼠肝脏组织HE染色结果(HE×200)

表5 对高脂血症模型组大鼠血清中SOD、MDA、GSH-PX水平的影响

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

表6 对高脂血症模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平的影响

4 讨论与结论

高脂血症作为由机体内脂质代谢紊乱引发的血浆中脂质浓度升高的疾病，其临床表现为体质量增加，血清TC、TG以及LDL-C水平过高，HDL-C水平过低[10]。本研究表明，经口给予旋覆花总黄酮能够在不影响大鼠进食量的情况下抑制体质量增加，同时降低高血脂症模型大鼠肝脏中胆固醇水平、粪便中胆汁酸水平、血清中TC、TG及LDL-C水平，提高HDL-C水平，具有改善高脂血症临床症状。

胆固醇在肝中不断代谢为胆汁酸，其随胆汁排入肠腔，参与脂肪的消化与吸收。随后约95%胆汁酸再经小肠被重吸收，形成“肝肠循环”而重复利用。本研究结果显示，旋覆花总黄酮能够促进胆汁酸排泄，进而阻止机体对于胆汁酸的吸收，以抑制肝肠循环，进而达到降低肝脏中胆固醇的效果。

同时，实验探究了旋覆花总黄酮对高血脂症大鼠血清相关指标的影响。结果显示，高血脂症大鼠血清中脂质过氧化反应总产物MDA水平增加，而抗氧化酶GSH-PX和SOD活性极显著下降，表明高脂血症大鼠脂质过氧化水平增加和自由基清除能力下降。经口给予旋覆花总黄酮后，大鼠血清中的GSH-PX和SOD活性均显著提高，MDA含量显著降低，即旋覆花总黄酮可能通过提高机体抗氧化活性，降低体内自由基的水平，改善高脂血症大鼠体内氧化-抗氧化失衡状态。

在高血压、高血脂症、动脉粥样硬化患者血浆中，炎症因子水平发生明显变化，其由脂肪组织分泌产生，参与炎症反应，且在脂肪分解代谢中发挥作用。促炎及抗炎因子的失衡可导致脂肪肝，研究显示，高血脂症大鼠的血清中TNF-α、IL-6水平显著升高，IL-10水平显著降低，经口给予旋覆花总黄酮后，大鼠血清中TNF-α、IL-6水平显著降低，IL-10水平显著升高，其能够缓解高脂血症低度炎症状态。

有大量的研究报道，中药黄酮类具有改善脂肪肝的作用，如山楂总黄酮、甘草总黄酮、大豆异黄酮等[11-14]。但其改善脂肪肝的机制也存在着不同，如山楂总黄酮、大豆异黄酮主要作用机制是抗氧化作用[11-12]，甘草总黄酮是通过激活AMPK信号分子改善脂肪肝[13]。而本研究表明旋覆花总黄酮的作用机制是多方面的，除抗氧化作用外，具有促进胆汁酸排泄及抑制炎症的作用，进而发挥降血脂及改善脂肪肝的作用，这也为旋覆花治疗脂肪肝奠定了理论基础。