三七不同部位化学成分的差异性研究△

沙孟晨，周永峰，张海珠*，李杨，秦琴

(1.大理大学 药学与化学学院，云南 大理 671000；2.解放军第302医院 全军中药研究所，北京 100039 )

三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen 的干燥根及根茎[1]。主产于我国云南，是我国传统名贵中药材。三七历来享有“人参之王”的美誉，三七中的总皂苷为三七的主要药理活性成分，其含量约为12%[2]，具有散瘀止血，消肿定痛的功能。现代研究表明，三七具有活血止血[3-4]，抗肿瘤[5-6]以及调节免疫[7]等多种功效。另外，在三七在治疗心血管疾病方面也具有独特疗效[8]。近年来，随着研究者的深入研究，三七药用价值得到广泛的开发，需求量逐渐增加。三七的道地产区目前公认为文山州[9]，但是目前文山州适宜种植三七的土地资源已经非常紧缺，主要原因是土地的连作障碍，因此严重影响了三七的市场供应量。

《中华人民共和国药典》2015版规定三七为其原植物的根和根茎，其中三七主根为临床主要用药部位[1]。三七主根主要由表皮、皮层以及木质部三部分组成，此外，三七还包括侧根，绒根，剪口等部分。三七总皂苷提取物生产厂家常用三七剪口或侧根为原料，民间也有使用三七叶和三七花[10]。为对三七的药用价值进一步充分开发挖掘，充分合理的利用三七的不同部位，本实验在总结比较前人实验研究后，比较系统的对三七药材中不同部位的化学成分差异进行了研究，以期为三七药材不同部位的合理应用提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 材料

三七药材分别采于云南省文山市，玉溪市以及昆明市等种植基地，为同一批次3年生样本，共计15份，如表1所示。所有药材均经大理大学药学院夏从龙教授鉴定为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎，将其分为表皮、皮层、木质部、侧根、绒根及剪口等部分。

表1 三七样品采集信息表

1.2 仪器与试剂

安捷伦1120HPLC，KQ-500DE型超声清洗器(工作频率：50 Hz超声电功率：250 W)，AB135-S型电子分析天平，DFT-50型手提式高速万能粉碎机。实验用水为哇哈哈纯净水，除甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

对照品三七皂苷R1(批号：110745-200617)、人参皂苷Rg1(批号：110703-201027)、人参皂苷Rb1(批号：110704-201122)、人参皂苷Rd(批号：111818-201001)、人参皂苷Re(批号：110754-200822)均从成都普瑞法科技开发有限公司购买，纯度均≥98%。

1.3 化学含量测定

1.3.1 色谱条件 色谱柱为Waters Acquity HSS T3 柱(2.1×100 mm，1.7 μm)，流动相为乙腈(A)和水(B)的混合物，梯度洗脱程序为：0.00～5.00 min：15%～17% A；5.01～10.00 min：17%～21% A；10.01～15.00 min：21%～60% A；检测波长210 nm，进样量为2.0 μL，流速0.30 mL·min-1，柱温30 ℃，柱平衡时间为2分钟。

1.3.2 对照品溶液的制备 分别称取三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd对照品适量，以分析天平精密称量，经过色谱级甲醇超声溶解后[11]，置于10 mL 容量瓶中，补足过程中失去的重量后定容至刻度线，然后用微孔滤膜 (0.22 μm)滤过，依次得到浓度为0.108 4、0.164 3、0.193 2、0.190 1、0.167 3 mg·mL-1的对照品溶液，备用。

1.3.3 供试品溶液的制备 将表皮、皮层、木质部、侧根、绒根以及剪口等三七各部分样品粉碎，分别精密称取各样品粉末 0.30 g，置于具塞三角瓶中加甲醇 25 mL，密塞后称定重量，摇匀，放置过夜，超声(250 W，50 Hz)提取30 min，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足失量，摇匀，过滤，取续滤液，提取液用微孔滤膜 (0.22 μm)滤过，即得供试品溶液[12]。

1.3.4 精密度考察 精密吸取“1.3.2”项下中间浓度的混合对照品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件，连续进样 6 次，记录峰面积，计算 RSD。

1.3.5 重复性考察 精密称取同一样品 6份，按“1.3.3”项下方法平行制备三七供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样，计算各皂苷类成分的含量。

1.3.6 稳定性考察 取同一供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件分别于制备后的0、3、6、12、24 h进样测定，以峰面积计算 RSD。

1.3.7 线性关系考察 精密吸取“1.3.2”项下的混合对照品储备液，依据“1.3.1”项下色谱条件，分别进样0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0 μL，记录各色谱峰峰面积，进行线性回归，纵坐标为峰面积，横坐标为进样量(μg)，得到回归方程。结果(表 2)表明各成分线性关系良好。

1.3.8 加样回收率实验 取同一批号且含量已知的三七样品粉末0.1 g共6份，精密称量，并分别精密加入与样品中等量的三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd对照品溶液，按照“1.3.3”项下方法制成供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进行测定。计算各皂苷类成分的含量和加样回收率。

1.3.9 样品含量测定 分别取三七的表皮、皮层、木质部、侧根、绒根以及剪口的各部分样品，用“1.3.3”项下方法制成供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进行测定，并记录峰面积，用外标法计算样品中5种皂苷类成分的含量，结果见表 2。

1.4 统计学分析

偏最小二乘判别分析(PLS-DA)：对不同批次三七药材不同部位中的5种皂苷类化学成分的含量进行综合分析，分析软件为SIMCA-P+11.0版软件，以考察三七药材不同部位的总体差异，统计学参数为软件默认的参数。

聚类分析：采于Metaboanalyst(http：//www.metaboanalyst.ca/)在线分析对三七药材不同部位的化学成分进行聚类分析。

2 结果

2.1 方法学考察

采用“1.3.1”项下条件，典型色谱图如图1所示。方法学考察结果(见表2)表明本实验所采用方法能够有效分离5种皂苷类成分，分离效果好，溶液制备方法简单，实验操作简便，重复性好，因此可用于测定三七药材5种皂苷类成分的含量。

用超高效液相色谱法测定五种化合物的并对其进行方法学考察。表2数据表明化合物在线性范围内的浓度和峰面积具有较好的关系(r≥0.999 9)。五种化合物的重现性相对偏差较小，(RSD≤0.31%)，稳定性好(RSD≤0.32%)，仪器精密度较高(RSD≤0.68%)，加样回收率较高，化合物分析损失程度低(RSD≥97.6%)。这些结果表明，该方法灵敏度高，线性拟合度较好。

注：A.对照品色谱图；B.三七样品色谱图；1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Re；4.人参皂苷Rb1；5.人参皂苷Rd图1 三七UPLC色谱图

2.2 含量测定

不同皂苷类化学成分在三七不同部位的主要分布情况见图2。

实验结果表明5种皂苷类化学成分在三七不同部位的上分布具有一定的差异性，其中剪口含量较高而绒根则含量较低。对于临床常用的三七主根而言，其表皮，皮层以及木质层中皂苷的含量均较高。

表2 方法学考察结果

注：A.三七皂苷R1的含量；B.人参皂苷Rg1的含量；C.人参皂苷Re的含量；D.人参皂苷Rb1的含量；E.人参皂苷Rd的含量；F.5种皂苷的总含量。图2 三七不同部位化学成分的含量

2.3 不同部位与化学成分含量的相关性分析

以5种不同的化学成分为参数对三七药材的不同部位进行聚类分析，结果表明三七药材的不同部位其物质基础同样存在显著的差异性，从聚类结果中可发现三七药材中的不同部位根据其化学成分的差异大致可分为三大类，其中侧根和皮层的化学成分含量相近可大致划分为一类，绒根因其所有化学成分含量均较低而单独分为一类，三七药材中的剪口、表皮以及木质部划分为一类。

注：1.剪口；2.侧根；3.绒根；4.表皮；5.皮层；6.木质部。图3 三七药材不同部位与化学成分含量的聚类热图

以5种不同的化学成分为参数对三七样品的不同部位进行PLS-DA分析，实验结果表明三七样品的不同部位在一定程度能够区分，其中说明其物质基础是具有显著差异性的，其中绒根、剪口、表皮以及木质部均具有一定的区分度，而侧根和皮层则由于其化学成分的关系区分度较低。其Loading Plot 分析结果表明在区分三七样品的不同部位时，5种皂苷类化学成分均具有较强的贡献程度，其中Rg1，Rb1和Rd作为主要的化学成分物质可用于区分三七样品不同部位。

注：1.剪口；2.侧根；3.绒根；4.表皮；5.皮层；6.木质部。图4 三七药材不同部位与化学成分含量的得分散点图

图5 三七药材不同部位与化学成分含量的载荷散点图

3 讨论

本实验通过UPLC法同时测定三七药材不同部位中5种皂苷类成分的含量，并进行方法学考察，实验结果表明UPLC法灵敏度高，准确性好。为了进一步对三七不同部位中5种皂苷类成分进行差异性分析，采用聚类分析，OPLS-DA分析等方法进行了初步的分析，实验结果表明三七药材中不同部位的化学成分含量的差异性较为显著，其中剪口部位5种皂苷类成分的含量最高，而绒根部位的化学成分含量则明显较低。

三七不同部位的含量测定结果表明三七药材剪口中5种皂苷类成分的含量均高于其他部位，并且三七药材中剪口，侧根以及绒根中5种皂苷类成分的化学含量均呈现出降低的趋势。三七主根的不同部位除人参皂苷Re的含量分布于表皮较多之外，其余四种化学成分的含量均没有显著性差异。实验结果提示三七不同部位因其化学成分的差异可用于不同的用途，如三七剪口和主根等部位因皂苷类化学成分含量较高，可作为三七的主要药用部位服务于临床，而绒根部位则化学成分含量较低，可用于相关医药企业有效成分提取的主要部位。

王国俊等[13]发现三七皂苷R1能够抑制白血病HL-60细胞的增殖并促使其凋亡，本实验结果显示三七剪口和木质部中三七皂苷R1的含量较高，对于该疾病的治疗，临床上可以选用三七剪口和木质部部位入药。有研究发现[14]，三七皂苷Rb1通过雌激素受体调节色素上皮衍生因子PEDF来抑制内皮细胞管状结构形成。本实验结果可指导该疾病治疗上三七入药部位，其中剪口、木质部、皮层的含量相对较高，提高三七药材的合理使用率。

综上所述，本实验为三七不同部位的合理应用提供了一定的理论依据。有效的提高三七药材的利用率。