山黧豆CASase基因DNA全长序列的扩增及CRISPR/Cas9敲除载体的构建

陶英杰，刘凤娟，毕春晓，任雪冰，曲瑞红，李科友，徐全乐

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌712100)

山黧豆(LathyrussativusL.)具有与大豆相媲美的蛋白含量，是山黧豆属(Lathyrus)187种作物中最具经济价值和广泛种植的栽培品种[1]，其发达的根系、与根瘤菌共生等生物学特征，使得山黧豆有极强的耐贫瘠性和抗旱性[2]。然而，和大多数豆科作物一样，其体内Cys、Met等含硫氨基酸水平较低[3-4]。这与其存在内源毒素β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)一起被认为是山黧豆神经性中毒的2个并行因素[5]。实际上，β-ODAP的生物合成与含硫氨基酸的生物合成密切相关[6-7]。β-ODAP生物合成的直接前体是β-异噁唑啉-5-酮-2-L-丙氨酸[β-(isoxazoline-5-on-2-yl)-L-alanine，BIA]，BIA由异噁唑啉-5-酮(isoxazolin-5-one)与O-乙酰丝氨酸(O-acetylserine，OAS)在β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase,CASase)催化下生成[8]。同时，OAS还可以在半胱氨酸合成酶(cysteine synthase，CSase)催化下生成Cys，这导致β-ODAP的积累与Cys的合成呈负相关。因而，同属β取代基丙氨酸合成酶家族(β-substituted alanine synthase，BSAS family)的CSase和CASase在此过程中可能扮演着重要作用[5,9]。尤其是CASase，在山黧豆β-ODAP与硫、氮代谢平衡中可能起到分子开关的作用[5]。

研究表明，山黧豆的CASase活性与其苗期BIA的迅速积累呈显著正相关[10-11]。CASase基因表达水平也与β-ODAP积累模式相符[5,12]。根据山黧豆CASase基因的cDNA序列推测CASase蛋白氨基酸序列与大豆、拟南芥的CASase蛋白序列分别具有88%和79%的一致性，差异主要体现在N端的信号肽序列，且三维结构高度相似[5,13-14]。这种结构的保守性对于依赖于辅因子磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)的BSAS家族发挥生物学功能至关重要[14]。在大豆CASase中，PLP的结合位点是Lys95[14]。构建大豆CASase蛋白的K95A点突变体发现，突变体蛋白结构中的吡啶环相对于野生型发生了15°的位移，并导致了CASase活性的丧失[14]。……