苹果树腐烂病菌发酵液中根皮苷主要降解成分分析

李春阳 曲新生 李书芳

1 试验目的

根皮苷是一种存在于植物组织中的物质，在苹果树组织中含量很高，被认作是苹果树贮存碳水化合物的一种形式。苹果树腐烂病是一种苹果树皮干腐烂病，通常是由于感染苹果黑腐皮壳菌所引起的，苹果树腐烂病可以侵染苹果树的多个部位，严重影响了苹果树的健康，从而造成经济上的损失。虽然国内外已经有很多人研究了苹果树腐烂病菌，但还未有人准确表明到底是何种物质使得苹果树中根皮苷发生降解。因此，现以苹果树腐烂病的病原菌及发酵液中的多种物质作为研究对象，对根皮苷的降解进行试验研究，进而分析出影响根皮苷降解的物质，从而揭示出腐烂病的发病机理，为苹果树的种植管理提供理论依据。

2 试验方法

2.1 以根皮苷为碳源培养的病原菌发酵液及其对根皮苷的降解作用 将根皮苷作为培养病原菌的碳源，并保持培养基中的根皮苷浓度为1 g/L。在培养基中加入几块苹果树腐烂病菌菌饼，室温培养，培养过程中保持静置，每天定时进行振摇。培养10 d左右，用布氏漏斗进行抽滤，得到病菌菌丝，在烘箱中80 ℃烘干并称取质量。取另一份发酵液，用滤膜过滤，将得到的无菌发酵液稀释10倍，检测根皮苷含量，试验过程中将不接菌培养作为对照物[1]。

2.2 以淀粉为碳源培养的病原菌发酵液及其对根皮苷的降解作用 发酵液的发酵方法与根皮苷为碳源的方法一致，发酵培养30 d左右，用滤膜过滤，将得到的无菌发酵液稀释至含根皮苷0．1 g/L，摇匀静置10 d后检测根皮苷含量，检测过程中以0．1 g/L根皮苷溶液作为对照物。

2.3 有机酸、蛋白类物质对根皮苷的降解作用 首先，将以离子交换树脂进行溶胀处理，随后用4%盐酸浸泡0．5 h后抽滤，用二次水洗至中性。然后，用3%氢氧化钠溶液浸泡0．5 h，再进行抽滤并洗至中性。将预处理好的树脂装柱，将无菌发酵液倒入柱子中，使有机酸交换到阴离子交换树脂中，过完柱子后用0．15 mol/L的氨水进行脱洗，脱洗后的溶液减压蒸馏出去残留氨水，用盐酸调至pH为3．5，得到有机酸液。在有机酸液中加入硫酸铵，沉淀发酵液中的蛋白类物质，用半透析膜进行透析处理得到粗蛋白液，将粗蛋白液进行冷冻干燥，得到蛋白类物质。发酵剩余液即除去有机酸和蛋白类物质之后的发酵液。将0．1 g/L的根皮苷水溶液作为对照标准，分别检测含根皮苷0．1 g/L的有机酸溶液、含根皮苷0．1 g/L的发酵剩余液以及汉根皮苷0．1 g/L、蛋白类物质1 g/L的水溶液。再分别配制含根皮苷0．1 g/L以及不同浓度蛋白类物质的水溶液，以空白物质作为对比参照物，测定不同浓度蛋白类物质对根皮苷降解的影响。对于根皮苷降解时间的影响则用含根皮苷0．1 g/L、蛋白类物质0．1 g/L的水溶液，分别在室温下静置降解不同时间[2]。

3 试验结果

3.1 苹果树腐烂病菌对根皮苷的降解作用 以根皮苷为碳源培养的腐烂病菌中，每100 mL发酵液含干质菌丝48 mg，说明苹果树腐烂病菌是以根皮苷作为碳源的。在病原菌发酵后，检测到的根皮苷低于不接菌培养的对照物，并且病原菌对根皮苷的利用率高达90%。

3.2 苹果树腐烂病菌发酵液对根皮苷的降解作用 通过淀粉培养的无菌发酵液在处理根皮苷后，发酵液中几乎不含根皮苷，说明发酵液中含有特定物质可以彻底降解根皮苷，而且无菌发酵液降解根皮苷的效率为99%以上。

3.3 发酵液中各其他成分对根皮苷的降解作用 之前分别提取了有机酸、蛋白类物质及发酵剩余液，并分别进行了根皮苷的降解试验，目的是为了找出发酵液中能够降解根皮苷的物质种类。经过对试验结果的分析，有机酸与发酵剩余液在试验后的溶液中根皮苷含量几乎没有变化，说明这两种物质根皮苷几乎没有降解作用。而蛋白类物质在试验后溶液中根皮苷含量明显降低，其对根皮苷的降解率在90%，说明发酵液中蛋白类物质才是降解根皮苷的主要活性物质。经推测，这些蛋白类物质的作用与降解细胞壁酶类相似。而且由试验结果可知，时间越长，蛋白类物质越多，对根皮苷的降解作用越明显。

4 结论

该文通过试验证明了根皮苷被苹果树腐烂病菌作为碳源长期利用的原因为：苹果树腐烂病菌发酵过后生成了某种特殊物质，从而产生了能够降解根皮苷的能力。随后又通过试验表明，苹果树腐烂病菌发酵过程中所产生的蛋白类物质是降解根皮苷的主要物质。发酵液中存在的有机酸类及发酵剩余液中其他物质对根皮苷的降解作用非常低，几乎不具有降解根皮苷的能力。至于蛋白类物质中何种物质起到主导作用，目前还无法确定，有待进一步研究。

[1]2017年苹果树腐烂病防控技术方案[J]．山东农药信息，2017（5）：22．

[2]郑庆伟．丁香酚、愈创木酚对苹果树腐烂病病原菌均有抑制效果[J]．农药市场信息，2017（20）：122-123．