甘草酸对酒精性肝损伤大鼠脏器的保护作用:18α-与18β-甘草酸配比的影响

2018-08-19 05:43孙晓可杨飒霍小位王士中孟祥波赵燕燕
现代食品科技 2018年7期
关键词:甘草酸脏器脾脏

孙晓可,杨飒,霍小位,王士中,孟祥波,赵燕燕

(1.河北大学药学院,河北省药物质量分析控制重点实验室,河北 保定 071002)(2.河北祁一堂药业有限公司,河北保定 071002)

酒精性肝损伤(Alcoholic Liver Disease,ALD)是由长期过量饮酒造成的一种复杂的代谢性疾病[1]。目前,ALD已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因,严重危害着人类的身体健康[2]。酒精的代谢产物如乙醛、乙酸及自由基等对机体的重要组织或器官造成广泛的氧化损伤,如肝脏、肾脏及脾脏等[2~4]。长期饮酒主要对肝脏造成损伤,病情若不断发展则可能导致肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌[5]。饮酒后部分酒精通过肾脏代谢,致使酒精代谢产物积聚在肾脏细胞和肾间质内,超出其代谢负荷,导致肾脏损伤[6],包括肾乳头坏死、感染性血管球性肾炎和急性肾功能衰竭[7~9]。酒精可引起免疫系统失调,导致脾脏细胞通透性增强,进而使机体免疫功能降低[4,10,11]。过量酒精摄入也能引起肠道通透性增加,损伤肠系膜,进而肠道菌群失调,内毒素进入肝脏,引起肝脏炎症反应[12]。

甘草,气微,味甜而特异,具有补肾益气、解毒保肝、润肠止咳、调和诸药、清热解毒等功效,是一味重要的传统补益中药[13]。甘草药材原植物主要是光果甘草(Glycyrrhiza glabra L),胀果甘草(Glycyrrhiza inflate Batal),甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)三种[14,15]。甘草酸是甘草的主要成分之一,C18位存在差向异构体,为 18α-甘草酸(18α-glycyrrhizic acid,18α-Gly)和 18β-甘草酸(18β-glycyrrhizic acid,18β-Gly)。甘草酸对酒精性肝损伤的保护机制和疗效已经被广泛报道[16,17]。然而,不同配比的18α-Gly与18β-Gly差向异构体对酒精性肝脏、肾脏和脾脏损伤的保护作用的研究尚未见报道。

本研究旨在通过观察不同配比 18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠重要脏器指数的影响,分析肝脏、脾脏和肾脏的形态学变化以进一步筛选出18α-Gly与18β-Gly的最佳配比,为临床用药提供实验数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性大鼠(Sprague-Dawley,8周龄),SPF级,100只,购于北京斯贝福生物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0002。

1.2 主要仪器

万分之一天平,德国赛多利斯;MICROM HM 325手动轮转式石蜡切片机,赛默飞世尔科技公司;Leica CM1860冰冻切片机,德国莱卡;ZEISS Primo Start显微镜,德国蔡司公司;超低温冰箱,北京天寒超低温设备科技有限公司。

1.3 药品和试剂

异甘草酸镁注射液(18α∶18β=500∶1[18],批号160125104,规格 50 mg/支)正大天晴药业集团股份有限公司;注射用复方甘草酸单铵 S(18α∶18β=1∶109[18],批号 20151201,规格 40 mg/支),山西普德药业股份有限公司;水飞蓟宾胶囊(纯度>99%,批号650701013,规格35 mg/粒),天津天士力圣特制药有限公司;无水乙醇(批号20160301),天津市风船化学试剂有限公司;生理盐水(批号1604060503),石家庄四药有限公司;40%甲醛饱和水溶液(批号20160210),天津市华东试剂厂;苏木精、油红O,北京索莱宝科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制备与动物分组

SD大鼠适应性喂养一周之后,随机分为 10组(n=10),即正常对照组(Normal)、模型对照组(Model)、水飞蓟宾阳性药物对照组(Silymarin)、7个18α-Gly与18β-Gly不同配比药物组(浓度为10.83 mg/kg;配比为 10∶0,8∶2,6∶4,5∶5,4∶6,2∶8,0∶10)。水飞蓟宾溶液、18α-Gly与18β-Gly不同配比溶液均用0.9%氯化钠注射液配制。除正常对照组(0.9%氯化钠注射液,10 mL/kg)外,各组灌胃(ig)给予40%乙醇,10 mL/kg,制备大鼠酒精性肝损伤模型。药物组分别灌胃 18α-Gly和 18β-Gly不同配比溶液(10.83 mg/kg),阳性药物对照组给予水飞蓟宾溶液(22.75 mg/kg),正常对照组和模型对照组每100 g给予0.9%氯化钠注射液0.3 mL,连续灌胃4周。末次给药后禁食不禁水14 h,称重,10%水合氯醛3 mL/kg麻醉,腹主动脉取血,迅速解剖摘取肝脏、肾脏和脾脏等脏器,使用万分之一天平称重,置于10%甲醛固定,部分肝脏置于-80 ℃超低温冰箱冻存。

1.4.2 脏器指数计算方法

脏器指数(%)=脏器重量(g)/大鼠体重(g)*100%

1.4.3 肝脏油红O染色

取-80 ℃的肝脏组织,OTC包埋,组织横切片(10 μm)及油红O(Oil Red O)染色,使用蔡司显微镜在10倍镜下连续观察整个组织切片病变情况拍照保存。

1.4.4 肾脏和脾脏苏木精-伊红染色

取固定在10%甲醛中的肾脏和脾脏组织,石蜡包埋,组织横切片(4 μm)及苏木精-伊红(hematoxylineosin staining,HE)染色,中性树脂封片,使用蔡司显微镜下分别在10倍和40倍镜下连续观察整个组织切片病变情况并拍照保存。

1.4.5 统计学处理

应用 SPSS(19.0版)统计软件处理数据,并进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。实验数据以(¯x±s)表示,p<0.05 具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同配比18α-Gly与18β-Gly对大鼠酒精性肝损伤各大系统中重要脏器指数的影响型组相比,#p<0.05,##p<0.01,下同。

图1 不同配比18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠呼吸消化系统脏器指数的影响Fig.1 Effect of different ratios of 18 α-and 18β-Gly on respiratory and digestive system organs index in ALD rats

图2 不同配比18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠泌尿生殖系统和运动系统脏器指数的影响Fig.2 Effect of different ratios of 18 α-and 18β-Gly on urinary,reproductive and sports system organs index in ALD rats

实验考察不同配比18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠重要脏器指数的影响(见图1~3)。酒精导致大鼠重要脏器的损伤,引起大鼠生理功能的变化,如呼吸消化系统、泌尿生殖系统、运动系统和神经循环系统。酒精对呼吸消化系统脏器造成损伤,肝脏、胰腺、肠系膜和肺指数受到影响。与正常对照组比较,酒精模型组的肝脏指数显著升高,肠系膜和肺指数明显降低,胰腺指数没有显著性变化。与酒精模型组比较,18α-Gly 与 18β-Gly 配比为 10∶0、8∶2、4∶6 和 2∶8时肝指数明显降低;配比为2∶8和0∶10时可以显著升高肠系膜指数;配比为 10∶0、8∶2、6∶4、5∶5 和 2∶8 时肺指数显著升高,见图1a~d。酒精引起泌尿生殖系统和运动系统的损伤。与正常对照组比较,酒精模型组明显降低骨骼肌指数,肾脏指数、睾丸指数和股骨指数无显著性差异。与酒精的模型组相比较,18α-Gly与18β-Gly的配比为2∶8和0∶10时显著地增加骨骼肌的指数,具体结果如图2a~d所示。酒精对神经循环系统脏器指数产生影响。与正常对照组比较,酒精模型组的脑指数显著降低,心脏指数和脾脏指数显著升高。与酒精模型组比较,18α-Gly与18β-Gly配比为2∶8时显著升高脑指数;配比为 8∶2、6∶4、4∶6 和 2∶8 时心脏指数明显降低;配比为 8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8 和 0∶10时明显降低脾脏指数,见图3a~c。

上述结果表明,不同配比的 18α-Gly与 18β-Gly对重要脏器指数的影响不同。18α-Gly与18β-Gly配比为4∶6和2∶8时能显著降低呼吸消化系统中的脏器肝脏指数,改善呼吸消化功能;配比为2∶8和0∶10时极显著降低运动系统中骨骼肌指数,改善运动功能;配比为2∶8时明显升高脑指数,改善神经功能;配比为4∶6和2∶8时明显降低心脏指数和脾脏指数。

图3 不同配比18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠神经循环系统脏器指数的影响Fig.3 Effect of different ratios of 18 α-and 18β-Gly on nervous and circulatory organs index in ALD rats

2.2 不同配比18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠肝脏的形态学分析

图4 不同配比18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠肝脏形态学的影响Fig.4 Effect of different ratios of 18α-and 18β-Gly on livermorphology in ALD rats

实验考察不同配比18α-Gly与18β-Gly对肝脏组织的病理的分析,长期灌胃酒精后对大鼠肝脏造成不同程度损伤,包括肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。

肉眼观察(图4):与正常对照组比较,酒精模型组的肝体积增大,表面粗糙,油腻,质地软;与酒精模型组比较,18α-Gly 与18β-Gly 配比为4∶6 和2∶8 的肝脏体积恢复,表面油腻感降低。

肝脏油红O染色结果显示(图4):与正常对照组比较,酒精模型组肝细胞内可见大量红色脂滴,表明肝细胞内出现脂质沉积,造成肝脏损伤。与酒精模型组比较,不同配比的18α-Gly与18β-Gly对肝细胞内的脂质堆积影响不同,配比为4∶6和2∶8时,镜下可见肝细胞内红色脂滴减少,脂肪变性减轻。

2.3 不同配比18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠肾脏病理的影响

实验考察不同配比18α-Gly与18β-Gly对肾脏组织病理的影响。酒精约90%在肝脏代谢,部分通过肾脏代谢,引起肾功能下降,肾脏的损伤。

图5 不同配比18α-与18β-甘草酸对酒精性肝损伤大鼠肾脏病理的影响Fig.5 Effect of different ratios of 18 α-and 18β-Gly on kidney histology in ALD rats

肾脏HE染色结果显示(图5):正常对照组中肾小球血管袢薄且清晰,细胞正常。与正常对照组比较,酒精模型组肾小球血管袢模糊,玻璃样变,系膜细胞受损,毛细血管袢分辨不清,炎症细胞浸润。给予药物后,结果显示,18α-Gly和18β-Gly的配比为4∶6,2∶8和0∶10,肾小球炎症细胞减少,毛细血管袢清晰,轻度玻璃样变。

2.4 不同配比18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠脾脏病理的影响

实验考察不同配比18α-Gly与18β-Gly对脾脏组织的病理的分析。长期灌胃酒精后造成大鼠肝脏损伤,同时引起脾肿大,引起脾脏损伤。脾脏HE染色结果显示(图6):正常对照组脾脏红髓白髓分界清晰,细胞正常。与正常对照组比较,酒精模型组脾脏白髓内炎症细胞浸润,红髓内红细胞增多,红白髓分界模糊。给予药物后,18α-Gly和18β-Gly的配比为4∶6时脾脏红白髓分界清,白髓区明显扩大。

图6 不同配比18α-与18β-甘草酸对酒精性肝损伤脾脏病理的影响(H&E染色×10)Fig.6 Effect of different ratios of 18α-and 18β-Gly on spleen histology in ALD rats (H&E staining×10)

3 结论

3.1 长期过量饮酒,能够引起代谢异常,酒精代谢物(乙醛、自由基等)抑制脏器的生长发育,损伤组织[11]。动物的脏器指数是重要的生物学指标之一,且较为敏感,在一定程度上反应器官的功能强弱[19]。本试验中,采用酒精灌胃复制大鼠 ALD模型,研究酒精对肝脏和脾脏等脏器指数造成影响。结果表明,与正常对照组比较,酒精模型组呼吸消化系统、泌尿生殖系统、运动系统和神经循环系统中的脏器受到损伤,与文献研究一致[5~11];不同配比的 18α-Gly 与 18β-Gly对脏器指数的影响不同,18α-Gly与 18β-Gly配比为2∶8时能显著降低呼吸消化系统中的脏器指数,配比为2∶8和0∶10时极显著降低骨骼肌指数,配比为2∶8时明显升高脑指数,配比为4∶6和2∶8时明显降低心脏指数和脾脏指数。因此,18α-Gly与18β-Gly配比为2∶8和4∶6时明显改善体内各大系统的器官和组织的功能。

3.2 病理检测能够真实可靠的显示出组织的病理状态,在本研究中结合基础的H&E染色与油红O染色共同分析组织的病理学变化。Louvet A和Schaeffner E指出酒精对肝脏[1]和肾脏[3]有毒害作用。Pavón FJ等[4]研究间歇饮酒对青少年脾脏组织病理学的影响,发现酒精使脾脏内炎症细胞浸润,对脾脏造成损伤。本实验研究表明,酒精对肝脏、肾脏和脾脏造成损伤,且不同配比的18α-Gly与18β-Gly对组织的形态学改善作用不同,配比为4∶6和2∶8时肝细胞红色脂滴减少,脂肪堆积减少;配比小于或等于4∶6时肾小球炎症减轻,毛细血管袢清晰,玻璃样变减少;配比为4∶6时脾脏内界面红白髓分界清楚。因此,18α-Gly与18β-Gly配比为4∶6和2∶8时明显改善肝脏、肾脏、脾脏的组织结构。

3.3 本实验首次以脏器指数和病理学为切入点,研究不同配比18α-Gly与18β-Gly对酒精性肝损伤大鼠肝脏、肾脏、脾脏等脏器的影响。研究结果表明18α-Gly与18β-Gly的配比为4∶6和2∶8时,对ALD大鼠脏器有更好的保护作用。本研究将为甘草酸差向异构体的临床应用提供实验数据支持,但其深层机制仍有待于深入研究。

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