中田大山楂提取物对肝脏脂肪变性的保护作用分析

胡海杰，董青青，王秋彤，潘立文，张同存，罗学刚

(1. 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 贺州学院，贺州 542800)

近年来，人类高血脂的发生率呈明显上升的趋势[1]．高血脂能够诱发冠状动脉粥样硬化、心脏病和脂肪肝等，对人体健康危害极大．因此，预防和治疗高血脂具有十分重要的临床意义．山楂(Crataegus pinnatifida)是蔷薇科植物，自古药食两用，具有健脾开胃、消食化滞等功效．现代药理学研究证明，山楂具有预防和治疗高血脂的作用[2–5]．在我国，山楂可以简单地划分为两大类，即分布于华北地区的北山楂(俗称山里红)和分布于江浙、云贵、两广等地区的南山楂．目前，《中国药典》中所列山楂主要是北山楂品种，包括 Crataegus pinnatifida和 Crataegus pinnatifida var．Major这两类．近年来，随着人们对山楂越来越多的关注，新品种山楂也随之诞生，这些新品种山楂是否也具有与传统山楂相近的功效，尚有待研究确证．其中，中田大山楂是贺州学院潘中田教授从南方野生山楂(Crataegus cuneata)中挑选、嫁接培育而出的一种南山楂新品种，具有果大、丰产、抗逆能力强等优点[6]．前期实验已经证实中田大山楂也具有较好地降低高脂小鼠血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等血脂指标的功效，并发现其对胆固醇的降低作用主要是通过阻断 NF-κB核因子信号通路以抑制胆固醇合成限速酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)的转录表达而发挥的[7]，然而其对脂肪酸代谢以及肝脏脂肪变性的影响作用尚未阐明．因此，本文利用前期动物实验中所采集留存的组织样本，通过病理切片、RT-PCR分析中田大山楂提取物对肝脏的保护作用及降血脂机理．此外，利用体外培养的肝细胞优化建立了高脂细胞模型，并利用该模型进一步对中田大山楂提取物的直接作用进行了分析验证．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人肝癌细胞 HepG2细胞株为本实验室保藏，在DMEM/HG培养基中加入体积分数为 10%,的胎牛血清，于37,℃、5%, CO2培养箱培养．

1.1.2 实验动物

SPF级昆明种小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(许可证号：SCXK-(军)2012-0004)．

1.1.3 原料与试剂

中田大山楂为贺州学院潘立文教授惠赠，由本实验室经过索氏提取法制备获得提取物. DMEM/HG培养基，Gibco公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；M-MLV 逆转录酶、Trizol裂解液，上海英俊生物技术有限公司；随机引物，上海生工生物工程有限公司；dNTP、T4,DNA 连接酶、油酸、DMSO、异丙醇，Solarbio公司．

1.2 方法

1.2.1 中田大山楂主要成分的分析

中田大山楂的主要成分由广西壮族自治区分析测试研究中心根据国家相关标准进行分析测定．

1.2.2 中田大山楂提取物的制备

本实验使用乙醇进行索氏提取法制备获得提取物：取新鲜山楂果，洗净、去核、切片(1～2,mm)，60,℃烘烤 24,h，粉碎过 80目筛，得山楂粉．山楂粉中加入 10倍量(g∶mL)的 95%,乙醇，提取 3次，每次 2.5,h，过滤，合并滤液．滤液 65,℃减压蒸馏，得稀浸膏．加水至浸膏体积的两倍，混匀，4,℃静置 8,h，倾出上清液，沉淀部分过滤，弃掉滤液．取一定量的沉淀，加入 95%,的乙醇溶解，碱液调节 pH 8～9，产生大量沉淀，过滤，弃滤饼．取碱沉后的滤液，加入一定量的活性炭，回流30,min，放冷，过滤．取脱色后的滤液调节 pH 5～6，回收乙醇至尽，加入适量的水，4,℃静置 4,h，过滤，沉淀于 40,℃减压干燥，即得提取物．

1.2.3 高脂动物模型的建立

健康雄性昆明小鼠 60只，4周龄，(20±2)g，适应性饲养5,d后，随机分为6组，每组10只，具体分组及饲喂方式见表 1．其中高脂饲料配方(质量分数)为：基础饲料(市售常规小鼠饲料)78.8%,，蛋黄粉10%,，猪油 10%,，胆固醇 1%,，脱氧胆酸盐 0.2%,．

饲养条件：温度(22±2)℃，湿度 50%,～60%,，自由饮水、进食，其中受试样品中田大山楂低、中、高剂量组以及阳性对照辛伐他汀组每日灌胃给予相应药物，基础组和高脂对照组则每日给予等体积的PBS．每 2～3,d更换 1次垫料，每日自然光照，实验持续5周．

表1 实验动物分组及饲养方式Tab. 1 Experimental grouping and feeding mode

1.2.4 逆转录PCR(RT-PCR)

利用Trizol提取法将从小鼠肝脏提取的RNA用M-MLV 逆转录方法进行逆转录[8]．RNA 2,µg、随机引物 5,µL，70,℃水浴 5,min，迅速冰浴；10,mol/L dNTPs 5,µL 、 5× buffer 5,µL 、RNAse 抑 制 剂0.625,µL、M-MLVRT 1,µL 混匀，37,℃反应 1,h；70,℃保持10,min终止反应．

取 1,µL 产物进行 RT-PCR扩增，以 GAPDH 作为内对照，扩增体系为 25,µL：双蒸水 16.5,µL，10,mmol/L dNTP 2,µL，上、下游引物各 1,µL，100,µmol/L 10×PCR 缓冲液 2.5,µL，模板和酶各1,µL．PCR 条件：95,℃预变性 5,min；95,℃变性 30,s，共 28 个循环；54,℃退火 30,s，72,℃延伸 45,s；72,℃延伸10,min．引物序列见表2．

表2 RT-RCR引物序列Tab. 2 Primer sequence for RT-PCR

1.2.5 肝脏病理切片分析

将肝脏组织块投入 10%,福尔马林固定液中，再由体积分数 10%,～100%,乙醇作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水分．将组织块置于透明剂二甲苯中，再置于已熔化的石蜡中，最后放入熔蜡箱保温，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋．在切片机上切成很薄的切片，组织切片进行HE染色分析[9]．

1.2.6 高脂肝细胞模型的优化建立

以不加油酸的 HepG2细胞作为空白对照(Control)．用 1、2、3、4、5 µg/mL 的油酸对 HepG2 细胞诱导 48 h，5%,多聚甲醛固定 30 min，75%,乙醇洗涤 2次；油红染色 30 min，75%,乙醇洗涤 2次；置于65,℃烘箱 10 min后，用 100%,异丙醇溶解油红染色的细胞，在 600 nm 处测定吸光度，筛选出油酸最佳诱导质量浓度．此外，以最佳质量浓度的油酸分别对HepG2 细胞诱导 4、8、12、24、36、48、54 h，确定最佳诱导时间．

1.2.7 中田大山楂提取物对高脂细胞内油脂形成的影响作用分析

在确定了高脂肝细胞模型建立方法之后，进一步以 10、30、60 µg/mL 的中田大山楂提取物处理高脂细胞，通过油红染色分析确定中田大山楂提取物对细胞内油脂含量的影响作用．

2 结果与分析

2.1 中田大山楂主要成分分析

对中田大山楂的主成分进行了分析检测，结果见表 3．由表 3可知，中田大山楂含有丰富的维生素、氨基酸、微量元素、熊果酸、山楂酸、三萜类及黄酮类等活性物质．

表3 中田大山楂主要成分Tab. 3 Main components of Zhongtian hawthorn

2.2 中田大山楂提取物对高脂小鼠脂肪代谢关键酶的调控作用分析

脂肪细胞是机体合成及储存脂肪的仓库．当长期食用高热量、高胆固醇食品时会引起肥胖，甚至造成肝脏病变[10–12]．脂肪酸转运蛋白(fatty acid transport protein，FATP)是协调游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)摄取、携带脂肪酸跨越细胞膜转运的关键基因，激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACAC)则分别是脂肪分解和合成的限速酶[13-14]．

为了探索中田大山楂对脂肪代谢过程的调控机制，利用 RT-PCR与 qRT-PCR方法对饲喂中田大山楂提取物的高脂小鼠脂肪组织中 FATP、HSL、ACAC等的转录水平进行了分析，结果如图 1所示．由图 1可知，与正常对照组相比，高血脂组小鼠脂肪中FATP与ACAC均呈现出显著的上调，阳性对照降血脂药物辛伐他汀可抑制FATP与ACAC的转录表达，中田大山楂提取物可以明显上调 FATP、下调 ACAC的表达．而对于HSL，与模型对照组相比，中田大山楂提取物各剂量组均体现出明显的上调作用，其中高剂量组(130,mg/(kg·d))尤为突出，可使HSL 上调约1.6倍．这些结果说明中田大山楂可以通过抑制ACAC的转录表达，从而阻碍脂肪的生物合成．

图1 中田大山楂提取物对高血脂小鼠脂肪代谢关键基因转录水平的影响Fig. 1 Effect of Zhongtian hawthorn extract on the transcription level of key genes associated with lipometabolism in hyperlipidemia mice

2.3 中田大山楂提取物对高血脂小鼠肝脏脂肪变性的保护作用

肝脏是身体内以代谢功能为主的器官，并在身体里面起着去氧化，储存肝糖，分泌性蛋白质合成、产生胆汁等作用，而长期的高脂饮食则会导致肝细胞发生脂肪变性(即脂肪肝)，并逐渐演进为肝纤维化等症状[15–17]．本课题组在前期小鼠血脂实验结果已证实[7]，中田大山楂提取物在给药剂量为 50、90、130 mg/(kg·d)时可剂量依赖性地降低高脂小鼠血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等血脂指标并抑制肥胖，然而其对肝脏脂肪变性的影响尚未确定．因此，在前期工作基础上，本文进一步通过免疫组化对中田大山楂给予后高脂小鼠肝脏组织形态的变化情况进行了分析，结果如图 2所示．与基础饲料的正常对照组小鼠相比，高脂组小鼠的肝脏细胞形态紊乱，低剂量的中田大山楂提取物对小鼠肝脏保护作用不明显，而中、高剂量则可与显著缓解高脂饲喂所引起的小鼠肝脏病变．

图2 中田大山楂提取物对高血脂小鼠肝脏脂肪变性的保护作用Fig. 2 Protective effect of Zhongtian hawthorn extract on the hepatic steatosis in hyperlipidemia mice

2.4 中田大山楂提取物对高脂肝细胞的直接影响作用分析

通过上述研究发现，中田大山楂提取物可抑制体内脂肪酸生物合成并对高血脂小鼠的肝脏病变具有很好的保护作用．但这种功效究竟是直接作用于肝细胞产生，还是在体内吸收、分布、代谢等一系列过程中间接产生的作用？为了明确这一点并进一步验证中田大山楂提取物对肝细胞脂肪代谢及高脂化的保护作用，利用体外培养的 HepG2肝细胞构建了高脂细胞模型，并对其功能进行了分析验证．

2.4.1 高脂肝细胞模型建立条件优化

首先，对油酸诱导高脂细胞模型的最佳条件进行了优化．用 1、2、3、4、5 µg/mL 油酸对 HepG2细胞诱导48 h后，经油红染色后通过测定600 nm处的吸光度对细胞内油脂含量进行分析，结果如图 3(a)所示，在采用 4 µg/mL油酸处理后，HepG2细胞内油脂含量达到最大．采用4 µg/mL油酸对HepG2细胞诱导最佳时间进行优化，结果如图 3(b)所示，诱导 48 h效果后高脂模型的建立效果为最佳．

图3 高脂肝细胞模型的建立条件优化Fig. 3 Optimization of the established high fat liver cell model

考虑到测定吸光度的方法对细胞内油脂的分析特异性及灵敏度均有所不足．进一步通过油红染色方法对细胞内的脂肪情况进行了分析，结果如图4所示．4 µg/mL油酸诱导48 h后(HF)，显微镜下观察显示 HepG2细胞中的油脂含量(图中着色区域)显著上升．而再次将油红染色细胞用 100%,异丙醇溶解并测定600 nm处吸光度后，结果也显示与对照组相比高脂诱导细胞中的油脂含量确有显著增强(图 4(b))，表明体外高脂肝细胞模型构建成功．

2.4.2 中田大山楂提取物对高脂肝细胞内油脂含量的影响

分别用 10,µg/mL(ZTL)、30,µg/mL(ZTM)、60µg/mL(ZTH)的中田大山楂提取物处理 HepG2高脂细胞，利用油红染色检测细胞内油脂含量变化情况，结果如图 5所示．随着中田大山楂提取物剂量的增加，HepG2高脂细胞内油脂含量显著降低，表明中田大山楂提取物能够剂量依赖性地抑制肝细胞脂肪合成过程．

图4 高脂肝细胞模型中油脂含量的变化Fig. 4 Changes of the fat content in high-fat liver cell model

图5 中田大山楂提取物对高脂肝细胞内油脂含量的影响Fig. 5 Effect of Zhongtian hawthorn extract on the fat content in high-fat liver cells

3 结 语

本文首先在动物水平上明确了中、高剂量中田大山楂提取物(90,mg/(kg·d)、130,mg/(kg·d))对高血脂小鼠体内脂肪生物合成的抑制作用以及对肝脏病变的保护作用．之后，建立并优化了高脂肝细胞模型，在细胞水平上通过油红染色证实了60,µg/mL中田大山楂提取物可抑制肝细胞脂肪合成过程，为其相关功能食品及药品的开发提供了基础数据．此外，本文所优化确定的高脂肝细胞模型建立条件，对于降血脂活性物质的高通量筛选与评价也具有很好的实际应用价值．