抗人IgG和抗人IgM单克隆抗体的特性鉴定及应用

封青，郭春艳，王珍 ，李研，梁导艳，胡军

1.陕西省人民医院；2.西安交通大学 医学院第三附属医院；陕西 西安 710068

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）包括 IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等5类，主要存在于血浆中。IgM是机体被病毒入侵后最先分泌的抗体，是机体抗感染的先头部队，目前诊断病毒感染是活动性感染还是近期感染的指标就是IgM抗体检测。IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分，是机体感染病毒再次免疫应答产生的主要抗体，亲和力高，体内分布广泛，持续时间长，具有重要的免疫效应，是机体抗感染的主力军。IgG抗体检测不仅可用于对病毒的特异性诊断，还可作为判断传染病疫区以及疫苗研制期检测的有效指标[1-2]。疫苗研制对疾病防控起至关重要的作用，疫苗临床早期研究方法是将病毒注射到人体内，通过检测血清中的相关抗体来评价疫苗效价[3]，而疫苗效价评价的主要依据是人体血浆中的IgG抗体。

临床上主要通过血清学检测判断机体是否感染病毒，如采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测患者血清中的IgG和IgM抗体，检测试剂盒中的酶标二抗即为抗人IgG和抗人IgM。其原理是将病毒抗原包被在96孔酶标板上，加入患者血清，再分别加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgG和IgM抗体，若患者感染过该病毒，就可检出针对该病毒的特异性抗体。市售人血浆弓形虫[1]、血清囊虫[4]、结核分枝杆菌[5-6]、肺炎支原体[7]、人免疫缺陷病毒[8]、结核[9]、人抗乙脑病毒[10]、狂犬病毒[11]、EV71 肠道病毒[12]和抗双链 DNA[13]等 IgG 和IgM抗体检测试剂盒都是应用上述原理的。

ELISA是临床辅助诊断和流行病学调查中应用最广的方法[4]，准确率高、成本低、重复性好、报告速度快且适合批量检测，有助于病毒感染早发现早治疗。单克隆抗体具有高度特异性，是现有免疫学和血清学研究的重要工具，无论在医学研究领域还是传染性疾病诊断与治疗方面均已被广泛应用。为此，我们以人IgG和IgM为抗原，通过传统方法制备并鉴定抗人IgG和IgM单抗，为开发病原微生物抗体检测试剂盒提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

8周龄雌性BALB/c小鼠购自西安交通大学实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室提供；人IgG和人IgM购自Abcam公司；山羊抗小鼠酶标二抗购自中杉金桥公司；抗体亚型鉴定试剂盒购自SBA Clonotyping System/HRP购自Southern Biotech公司；HAT购自Gibco公司；单克隆抗体培养血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；HRP购自国安生物有限公司；检测腺病毒抗体、麻疹病毒抗体和流感病毒抗体试剂盒购自杭州金莱公司。

1.2 单克隆抗体的制备

以人IgG和人IgM为抗原分别免疫小鼠，抗原量为50 μg/只，用佐剂乳化，方法参考文献[14]。采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，经过3次克隆化筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，从而得到2株抗人IgG和2株抗人IgM单克隆抗体，分别命名为IgG-2、IgG-25、IgM-7和IgM-23。采用体内诱生法，分别大量培养杂交瘤细胞，并选择健康小鼠，先于小鼠腹腔注射0.3 mL石蜡油，1周后于小鼠腹腔注射阳性克隆的杂交瘤细胞108/只，待小鼠腹腔明显膨出，无菌取腹水并离心收集上清，分装保存。

1.3 单克隆抗体生物学特性分析

1.3.1 单克隆抗体亚型鉴定 用SBA Clonotyping System/HRP试剂盒测定，具体方法是以羊抗小鼠Ig类型的标准抗血清，采用酶联免疫双抗夹心法测定单抗与抗小鼠Ig类型和亚类的反应性，确定单抗的亚型。

1.3.2 单克隆抗体的纯化 单克隆抗体纯化采用饱和硫酸铵盐析沉淀法[15]，分别用50%、40%和33%的饱和硫酸铵依次提取3次，离心所得沉淀物用少许0.01 mol/L PBS（pH7.4）溶解，经透析，收集并冻干保存，用紫外吸收法测定4株抗体的蛋白含量，用间接ELISA法测定抗体效价。

1.3.3 单克隆抗体腹水纯化后效价测定 采用间接ELISA法，用pH9.6的碳酸盐缓冲液（2 μg/mL）分别包被抗原人IgG和人IgM，置4℃冰箱中过夜；洗板，用牛血清白蛋白封闭，37℃孵育1 h；弃液体，洗板3次，从1/10开始梯度稀释纯化的单克隆抗体，加板，37℃孵育1 h；弃液体，洗板3次，加入稀释至1/2500的羊抗鼠酶标二抗，37℃孵育1 h；弃液体，洗板5次，以TMB底物显色，2 mol/L硫酸终止显色，用酶标仪测定D450nm值。

1.3.4 单克隆抗体交叉鉴定 采用间接ELISA法，用pH9.6的碳酸盐缓冲液（2 μg/mL）分别包被抗原人IgG、人IgM、牛血清、鸡血清、兔血清和羊血清，置4℃冰箱中过夜，洗板，用牛血清白蛋白封闭，37℃孵育1 h；弃液体，洗板3次，加入单克隆抗体上清原液，同时以SP20细胞培养上清为阴性对照，37℃孵育1 h；弃液体，洗板3次，加入稀释至1/2500的羊抗鼠酶标二抗，37℃孵育1 h；弃液体，洗板5次，以TMB底物显色，2 mol/L硫酸终止显色，用酶标仪测定D450nm值。

1.3.5 HRP标记4株单克隆抗体 用HRP标记抗体须借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。本实验室单克隆抗体标记采用改良碘酸钠标记法[16]，HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱，从而达到标记的目的。标记完成后采用间接ELISA法测定酶标抗体的最佳稀释率。

1.3.6 Western印迹鉴定单克隆抗体特异性 人IgG和人IgM蛋白分别加入等体积的上样缓冲液，100℃煮10 min变性，用氨基黑染色法定量蛋白浓度，配制浓度15%的分离胶，上样，进行SDSPAGE。电泳结束后进行印迹电泳，将PAGE胶中的蛋白质转移至NC膜上，3 h后取膜封闭1 h，洗膜3次，采用一步法直接加入HRP标记的单克隆抗体，4℃孵育过夜，洗膜5次，采用化学发光法显色，用化学发光成像系统成像。

1.3.7 夹心ELISA法鉴定单抗识别的表位 1个抗原分子表面常有多个抗原决定簇，用该抗原制备的单克隆抗体有的抗同一个决定簇，有的则抗不同决定簇。采用双抗夹心ELISA法包被抗人IgG-2与HRP标记的抗人IgG-25双抗夹心抗原，5 μg/mL人 IgG、0.5 μg/mL人IgG、5 mg/mL人血清和0.5 μg/mL人血清，以5 mg/mL羊血清为阴性对照；同样包被抗人IgM-7与HRP标记的抗人IgM-23双抗夹心抗原，5 μg/mL人IgM、0.5 μg/mL人IgM、5 mg/mL人血清和0.5 μg/mL人血清，以5 mg/mL羊血清为阴性对照。以TMB底物显色，2 mol/L硫酸终止显色，用酶标仪测定D450nm值。

1.3.8 单克隆抗体的应用 按照市售检测人腺病毒抗体试剂盒、麻疹病毒抗体IgM试剂盒和流感抗体试剂盒的说明，分别将试剂盒自带的阴、阳性血清加入相应试剂盒中的酶标板中，37℃孵育1 h，洗板后将HRP标记的抗人IgG-2、IgG-25、IgM-7、IgM-23、试剂盒中酶标二抗抗人IgG和IgM用合适的稀释浓度直接加至相应酶标板，37℃孵育40 min，洗板，以TMB底物显色，2 mol/L硫酸终止显色，用酶标仪测定D450nm值。

2 结果

2.1 阳性单克隆抗体的建立

应用成熟的单抗制备技术，最终获得2株抗人IgG和2株抗人IgM单克隆抗体，分别命名为IgG-2、IgG-25、IgM-7和IgM-23，经单抗亚类鉴定试剂盒测得4株单抗均为Kappa链，亚类均为IgG1。连续传代3个月后检测抗体效价和特异性，均与以往结果无差异，单抗特性稳定，均能稳定分泌抗人IgG和抗人IgM。

2.2 单抗腹水纯化后蛋白含量和效价测定

单克隆抗体经饱和硫酸铵盐析沉淀法纯化后蛋白含量都可达4 mg/mL以上，抗体效价均达到104以上（表1）。

表1 单克隆抗体纯化后蛋白含量和效价

2.3 单克隆抗体交叉鉴定

采用ELISA法，分别以人IgM、牛血清、鸡血清、兔血清和羊血清为包被抗原，检测4株单抗的特异性，结果见表2。2株抗人IgG-2和IgG-25单克隆抗体有很好的特异性，只与IgG反应，而不与人IgM、牛血清、鸡血清、兔血清和羊血清发生交叉反应；2株抗人IgM-7和IgM-23单克隆抗体有很好的特异性，只与IgM反应，而不与IgG、牛血清、鸡血清、兔血清和羊血清发生交叉反应。

表2 单克隆抗体的反应特性

2.4 HRP标记4株单克隆抗体

采用间接ELISA法确定标记抗体的最佳稀释率，抗人IgG-2最佳稀释率为1/104，抗人IgG-25最佳稀释率为1/103（图1A）；抗人IgM-7最佳稀释率为1/105，抗人IgM-23最佳稀释率为1/104（图1B）。

图1 间接ELISA鉴定HRP标记抗体的最佳稀释率

2.5 Western印迹鉴定单克隆抗体

HRP标记的抗人IgG-2和IgG-25识别的相对分子质量为50×103和25×103（图2A），HRP标记的抗人IgM-7和IgM-23识别的相对分子质量为80×103（图2B），符合预期大小。

图2 Western印迹鉴定单克隆抗体

2.6 夹心ELISA法鉴定单抗识别的表位

包被抗人IgG-2与HRP标记的抗人IgG-25可夹心出抗原人IgG，敏感值可达0.5 μg/mL，可检测出人血清中的IgG（图3A），说明2株抗人IgG-2和IgG-25识别的抗原位点不同；用同样方法无法夹心出人IgM（图3B），则说明2株抗人IgM抗体识别的抗原位点相同。

图3 夹心ELISA法鉴定单抗识别的表位

2.7 单克隆抗体的应用

按照试剂盒操作方法，在检测腺病毒抗体、麻疹病毒IgM和流感抗体病毒试剂盒中，抗人IgG-2、IgG-25、IgM-7和IgM-23更优于试剂盒自带的酶标二抗，结果如图4。

图4 单克隆抗体在3种试剂盒中的应用

3 讨论

我们通过常规单抗技术和免疫学方法，最终获得2株抗人IgG和2株抗人IgM单抗，为研制有效试剂盒、检测临床疾病及评估疫苗免疫水平提供了实验材料。此外，将这4株单抗运用到临床疾病特异性抗体检测中，可以更系统、更全面地掌握机体被病原体感染后产生的免疫应答反应所处状态，以便采取相应的防制措施，具有明显的应用价值。王平等[17]用抗牛血清IgG单克隆抗体建立了双抗体夹心法检测生物制品中残留的牛血清IgG。本研究用双抗夹心法对已建立的2株IgG和2株IgM识别的抗原表位进行鉴定，结果表明抗人IgG-2和IgG-25识别的的抗原位点是不同的，而且可以检测到人IgG，敏感值达0.5 μg/mL，这2株抗体可为后续建立双抗体夹心ELISA法检测人血清中的IgG提供实验材料。

检测患者血清中针对某种病毒的IgG/IgM抗体，首先要选择特异性强、敏感度高的抗人IgG/抗人IgM。我们筛选的2株抗人IgG和2株抗人IgM单抗的效价都可达104以上，分泌Ig亚类分属IgG1，均为可稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，比市售试剂盒中的抗人IgG和抗人IgM的敏感度更高、更优。

临床检测病毒感染方法多样，主要有病毒培养、PCR检测和ELISA检测等。病毒培养是诊断金标准，但其阳性率低，培养时间久，操作不慎还可引起感染；PCR检测对设备要求高，操作复杂，成本较高，实验周期长[18]，有些医院不具备检测条件。血清中的IgM在病毒感染1周后就可产生，2～3周达高峰期，所以目前IgM抗体ELISA检测已作为病毒急性期感染诊断指标，提高了临床诊断效率。市售试剂盒中的抗人IgG/抗人IgM大多为羊源性多抗，与其相比，我们的鼠源性单抗成本低、特异性强、敏感度高、操作简便、产量更高。