具有α-葡萄糖苷酶抑制作用益生菌的筛选及特性分析

王 芬，刘 鹭，李函彤，张书文，芦 晶，逄晓阳，汪建明,*，吕加平,*

糖尿病是一种由于胰岛素分泌不足（I型）或胰岛素抵抗（II型）引起的一种内分泌代谢紊乱性疾病，其特点是慢性高血糖症[1]。目前糖尿病已成为一种主要的慢性疾病，对人类的生活和健康造成了巨大的损害[2]，其中多数患者为II型糖尿病，主要特征有高血糖、低度炎症、β细胞损坏、胰岛素抵抗及系列并发症[3]。根据世界卫生组织的数据显示，至2017年，中国糖尿病的患病率已居世界首位，人数约1.1亿，约占中国成年人总数的1/10。依照目前发展趋势，到2040年，我国患者将超过1.5亿。因此，急需通过有效措施预防和治疗糖尿病。

食物中的碳水化合物在肠道内主要以单糖的形式被吸收。人体摄入的淀粉等多糖物质被唾液和胰α-淀粉酶降解生成寡糖及二糖后，还需要在肠道黏膜α-葡萄糖苷酶的作用下酶解生成葡萄糖后才能被吸收[4]。因此，α-葡萄糖苷酶已成为抑制碳水化合物吸收、降低血糖药物开发的有效靶点。目前，已在临床上应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类降血糖药物主要有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇[5]。α-葡萄糖苷酶抑制剂主要通过可逆性竞争α-葡萄糖苷酶与糖的结合位点，限制或延缓碳水化合物在肠内的分解和吸收，有效推迟并减轻糖尿病人餐后血糖升高的时间及进程，进而发挥降糖作用[6]，因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂主要适用于以碳水化合物为主食的人群，特别是中老年糖尿病患者[7]。

目前大量研究表明，一些益生菌的降血糖、抗氧化能力对人类II型糖尿病的治疗起到了有益的作用。Lactobacillus rhamnosus CCFM0528可以显著降低STZ诱导的II型糖尿病小鼠的空腹、餐后血糖、糖基化血红蛋白、内毒素、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6和白细胞介素-8水平[8]。Ejtahed等[9]发现嗜酸乳杆菌和双歧杆菌可以改善II型糖尿病人的空腹血糖。何秋雯[10]报道益生菌干酪乳杆菌（L. casei Zhang）对预防和稳定STZ所致的II型糖尿病大鼠的血糖升高、血液及尿液电解质紊乱具有一定的改善作用。乳酸菌G15和Q14能够显著改善糖尿病大鼠的糖耐量，降低糖基化血红蛋白，改善II型糖尿病大鼠胰岛β细胞受损及体重减轻的症状[11]。Moroti等[12]发现嗜酸乳杆菌和双歧杆菌显著降低糖尿病老年患者血糖水平。Chen Pei等[13]报道干酪乳杆菌CCFM0412具有较好的α-葡萄糖苷酶酶活的抑制率（29.61%）及较高的抗氧化能力。

2001年，联合国粮农组织/世界卫生组织对益生菌的定义是“摄入量足够时对机体产生有益作用的活性微生物”[14]。Del Piano等[15]认为益生菌应该是“在一定程度上能耐受胃液，胆汁和胰脏分泌物而黏附于肠道上皮细胞，并在空肠和回肠大量繁殖的一类活的微生物”。因此，菌体细胞对胃肠道环境具有较高的耐受性对于发挥益生作用至关重要[16-17]。本实验从菌株的细胞代谢物（cell-free excretory supernatants，CFS）和细胞内容物（cell-free extracts，CFE）对实验室保藏的77 株益生菌进行了降糖作用的筛选；在此基础上，充分模拟人体的消化环境对筛选的菌株进行评估；最后通过主成分分析筛选出1 株既具有潜在α-葡萄糖苷酶抑制作用又能很好的在体内生存的益生菌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

77 株益生菌（表1）由中国农业科学院农产品加工研究所乳品实验室保藏。

4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、黏蛋白II、黏蛋白III、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆盐、cFDA-SE染液 美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯。

表1 77 株菌株来源及编号Table 1 Information about 77 probiotic strains

续表1

1.2 仪器与设备

LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SK15离心机 美国Sigma公司；JY92-IIN超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；SPARK 20M多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；BD FACSCalibur流式细胞仪、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化及其菌落总数的测定

将冻存于-80 ℃的77 株甘油管保藏的益生菌接入MRS肉汤培养基中，于37 ℃恒温静置培养18 h，活化3 代后用于后续实验。

将活化好的菌株以体积分数4%的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37 ℃静置培养18 h，收集菌液，根据GB 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》[18]进行菌株菌落总数的测定，将菌液浓度调节为1×109CFU/mL。

1.3.2 样品的制备

1.3.2.1 CFS的制备[19]

益生菌在MRS培养基中37 ℃静置培养18 h后，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min收集菌体。将收集到的菌体用0.1 mol/L无菌PBS（pH 6.8）洗涤3 次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109CFU/mL，混匀。于37 ℃孵育12 h，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液，以0.22 μm水系微滤膜过滤得到CFS，-80 ℃保存。

1.3.2.2 CFE的制备[18]

益生菌在MRS培养基中37 ℃静置培养18 h后，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min收集菌体。将收集到的菌体用0.1 mol/L无菌PBS（pH 6.8）洗涤3 次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109CFU/mL，混匀，进行超声破碎。超声破碎条件：在冰浴的条件下，功率200 W，以3～5 s（工作3 s，停5 s）的脉冲破碎12 min。将超声后得到的液体于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液，以0.22 μm水系微滤膜过滤得到CFE，-80 ℃保存。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定[20]

取96 孔酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25 μL 20 mmol/L的PNPG及25 μL CFS或CFE，于37 ℃孵育10 min，再加入0.01 U/mL的α-葡萄糖苷酶50 μL，37 ℃反应15 min，最后加入100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，用酶标仪于405 nm波长处测定反应液的吸光度。用阿卡波糖作阳性对照，按公式（1）计算[21]：

式中：A1为含有酶不含样品的吸光度，样品用0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）代替；A2为不含酶不含样品的0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）吸光度；A3为含有酶含有样品的吸光度；A4为不含酶含有样品样液吸光度，酶用0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）代替。

1.3.4 16S rDNA基因测序

将筛选得到的菌株按体积分数4%（下同）的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37 ℃静置培养18 h。取2 mL菌液按细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组。用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测分析DNA的纯度及浓度，用细菌16S rDNA扩增通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）进行扩增[20]。采用琼脂糖凝胶电泳法对扩增产物进行检测。最后将扩增出的产物由北京华大基因研究中心完成测序。反应体系为DNA模板1 μL；Mix 12.5 μL；上下游引物各1 μL；加ddH2O 9.5 μL至总体积为25 μL。PCR条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s；62 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共35 个循环；第35个循环72 ℃延伸10 min。

1.3.5 益生特性的测定

1.3.5.1 益生菌耐酸性的测定

将益生菌以4%的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37 ℃静置培养18 h，在4 ℃、6 000 r/min离心10 min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH 2.0、3.0、7.0[23]的MRS肉汤培养基中，调节菌液浓度至1×109CFU/mL。于37 ℃孵育3 h，收集菌液，根据GB 4789.2—2010进行活菌计数。耐受性以存活率计算，见式（2）[24]：

式中：N1为经过耐受处理条件下的活菌数/（CFU/mL）；N0为pH 6.4（正常）MRS肉汤培养基中的活菌数/（CFU/mL）。

1.3.5.2 益生菌耐胆盐的测定

将益生菌以4%的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37 ℃静置培养18 h，于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH 8.0、含2%胆盐的无菌去离子水中[22]，调节菌液浓度至1×109CFU/mL。于37 ℃孵育24 h，收集菌液，根据GB 4789.2—2010进行活菌计数。耐受性的计算同公式（2）。

1.3.5.3 益生菌在人工模拟唾液、胃液、肠液中生长的测定

参考Versantvoort等[25]的方法配制模拟消化液，充分模拟人体口腔，胃肠道中的消化环境。

将益生菌以4%的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37 ℃静置培养18 h，于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，收集菌体。将收集到的菌体分别重悬于人工模拟的唾液（pH 7.0）、胃液（pH 2.0）、肠液（pH 8.0）中，调节菌液浓度至1×109CFU/mL。于37 ℃各环境分别孵育5 min、3 h、24 h，收集菌液，根据GB 4789.2—2010进行活菌计数。计算同公式（2）。

1.3.5.4 益生菌体外模拟的消化实验[26]

将益生菌以4%的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37 ℃静置培养18 h，于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH 7.0的模拟唾液中，调节菌液浓度至1×109CFU/mL。于37 ℃孵育5 min，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，收集菌体；将收集到的菌体继续重悬于pH 2.0的模拟胃液中，于37 ℃孵育3 h，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，收集菌体；最后再将收集的菌体重悬于pH 8.0的模拟肠液中，于37 ℃孵育24 h，收集菌液，根据GB 4789.2—2010进行活菌计数。计算公式同式（2）。

1.3.5.5 益生菌对HT-29细胞黏附性的测定

cFDA-SE对益生菌的荧光标记[22]：用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制1 mmol/L cFDA-SE的贮备液（称取5.0 mg cFDA-SE溶解于8.969 mL的DMSO试剂中），0.22 μm水系微滤膜过滤除菌，-20 ℃贮存备用。将筛选得到的益生菌以4%的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37 ℃静置培养18 h，4 ℃、3 000×g离心5 min，弃上清液，收集菌体。将收集到的菌体用无菌PBS洗3 次，重悬于PBS溶液中，调节菌液浓度至1×109CFU/mL。加入cFDA-SE贮液（1 mmol/L）至终浓度为20 μmol/L，于37 ℃避光静置20 min，4 ℃离心（5 000×g，10 min），弃上清液，收集菌体。再用PBS洗3 次，将菌体重悬于PBS溶液中，于488 nm激发波长下进行流式细胞检测，分析cFDA-SE的标记率。

HT-29细胞的培养：将HT-29细胞进行复苏后，按照1∶3的比例进行传代，传至新的培养瓶中，观察细胞生长状态。每1～2 d换液1 次，待细胞汇合度长至90%左右，弃去培养液，用PBS洗3 次，加入1 mL 0.25%胰酶，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中消化2 min，弃去胰酶，加入培养液终止消化，进行细胞计数，调整细胞数至1×105个/mL，进行铺板，观察细胞生长状态，待培养板中细胞汇合度长至90%～100%时即可进行细菌黏附实验。

益生菌对HT-29细胞的黏附性实验：将在24 孔板中培养好的HT-29细胞，用PBS洗3 次，分别加入500 μL的PBS，cFDA-SE标记的益生菌菌悬液；对照组为空白孔＋500 μL cFDA-SE标记的益生菌菌悬液。于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，用无菌PBS洗3 次。每孔加入350 μL 0.25%胰酶，于CO2培养箱中消化10 min，待细胞与培养板底部完全脱落，加入150 μL细胞培养液终止消化，混匀，取出100 μL悬液转入96 孔板中，用锡箔纸包好，测定其荧光强度。荧光检测条件：激发波长为485 nm，发射波长为530 nm。黏附率的计算为式（3）：

式中：A为HT-29细胞＋cFDA-SE标记的细菌菌悬液吸光度；A0为HT-29细胞＋PBS的吸光度；A1为cFDA-SE标记的细菌菌悬液吸光度。

1.3.6 主成分分析

筛选出具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株，对筛选菌株的α-葡萄糖苷酶抑制活性、耐酸性、胆盐耐受性、细胞黏附性及模拟胃肠液的耐受性等指标用SPSS 17.0软件进行主成分分析，筛选出可以很好地在胃肠发挥α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株。

1.4 数据分析

所有数据用 ±s表示，采用SPSS 17.0进行统计分析，利用Origin 8.0、Excel进行绘图分析。

2 结果与分析

2.1 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的筛选结果

由表2可以看出，筛选的13 株益生菌的CFS均表现出对α-葡萄糖苷酶的活性有抑制作用，抑制率可以达到2.53%～15.76%。阳性对照组阿卡波糖的抑制率最高，为26.75%；7 株益生菌的抑制率达到了10%以上，其中菌株GS-3对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，为15.76%；菌株BLP12、ST-2、1.1881的抑制率略低，分别为15.10%、13.44%、12.12%，该4 种菌株对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均可以达到阳性对照组阿卡波糖抑制活性的50%。且77 株益生菌的CFE对α-葡萄糖苷酶未呈现抑制作用，说明实验菌株的CFS提取物中含有抑制α-葡萄糖苷酶活性的物质，而CFE中不含或含有极少的该类抑制物，具体的结果还需要进一步的研究。根据抑制率结果，选出菌株GS-3、BLP12、ST-2、1.1881这4 株菌株进行体外模拟环境的耐受性实验。

表2 益生菌对α-葡萄糖苷酶酶活的抑制率Table 2 α-Glucosidase inhibitory rates of probiotics

2.2 16S rDNA基因测序结果

对筛选得到的4 株具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株进行菌种鉴定，由表3可以看出，该4 株菌分别属于干酪乳杆菌和植物乳杆菌。

2.3 益生特性的测定结果

益生菌类制剂在被人或动物食用后，只有在大量活菌顺利抵达、黏附并成功定植于回肠和结肠部位时，才能对宿主发挥益生作用[28]。在这一消化过程中，口腔中的环境，胃部的低pH值环境及胃液中胃蛋白酶等抗菌物质就成为阻碍益生菌进入肠道的第一道天然屏障。

2.3.1 益生菌的耐酸性

由图1可知，菌株编号为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在pH 3.0的酸性条件下孵育3 h后，均表现出了很高的存活率，分别为96.75%、108.69%、100.50%、96.93%，存活率均大于95%，其中GS-3、1.1881的存活率大于100%。分析有可能是pH 3.0的条件对GS-3、1.1881的生长无影响，甚至适宜这两株菌的生存，因此孵育期间反而增殖，造成存活率变高。此外，在pH 2.0的条件下，ST-2、GS-3、BLP12存活率很高，达到了70%。其中菌株ST-2的存活率最高，达到了75.97%；而菌株1.1881在pH 2.0的条件下存活率很低，仅为6.19%，说明其对酸敏感。总体来看，这3 株菌在这2 个pH值下的生存趋势是一致的。Matsumoto等[29]研究发现菌株的耐酸能力大小与菌株的H＋-ATP酶活性有关。因此，本实验中的干酪乳杆菌具有较好的耐酸能力，可能与其H＋-ATP酶活性有关。

图1 益生菌对酸性条件的耐受性Fig. 1 Tolerance of probiotics to low pH

2.3.2 益生菌对胆盐的耐受性

图2 益生菌对胆盐的耐受性Fig. 2 Tolerance of probiotics to bile salt

由图2可知，菌株编号为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在含2%胆盐的去离子水中孵育24 h后，生长状况不一。其中菌株ST-2的存活率最高，能达到1.63%，活菌数能达到2.86×107CFU/mL，菌株BLP12的存活率略低，为0.70%，且活菌数为1.96×107CFU/mL，编号1.1881的菌株存活率最低，活菌数达到1×105CFU/mL，说明不同菌株对胆盐的耐受性不同。

2.3.3 益生菌在模拟唾液中的耐受性

由图3可知，菌株编号为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在模拟唾液中的生长状况良好。以pH 7.0的MRS肉汤培养基中的活菌数为对照时，存活率均达到了94%以上；以pH 6.4的MRS肉汤培养基中的活菌数为对照时，存活率均达到了97%以上，菌株ST-2和菌株GS-3的存活率超过了100%；且这4 株菌株均更适宜在pH 7.0生长，同时可以看出无论以哪种条件为对照，结果均是菌株GS-3的存活率最高，ST-2次之，且各菌株之间的存活率没有显著差异。

图3 益生菌在模拟唾液中的耐受性Fig. 3 Tolerance of probiotics to simulated saliva

2.3.4 益生菌在模拟胃液中的耐受性

图4 益生菌在模拟胃液中的耐受性Fig. 4 Tolerance of probiotics to the simulated gastric juice

由图4可知，菌株编号为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在模拟胃液中生长情况不一，其中，菌株ST-2、GS-3存活率较高，分别为76.65%，68.81%；菌株1.1881、BLP12的存活率较低，分别为47.32%、52.49%，基本能达到50%左右。同时菌株ST-2、GS-3、BLP12在pH 2.0 MRS肉汤培养基中的存活率均大于在模拟胃液中的存活率，其中ST-2、GS-3的存活率在两种环境下的差异不大，但菌株BLP12在pH 2.0 MRS肉汤培养基中的存活率明显高于在模拟胃液中的存活率。与上述3 株菌不同的是，菌株1.1881在pH 2.0 MRS肉汤培养基中的存活率明显低于在模拟胃液中的存活率。

2.3.5 益生菌在模拟肠液中的耐受性

由图5可知，菌株编号为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在模拟肠液中的生长状况良好，其中菌株1.1881、GS-3、BLP12的存活率均大于90%，菌株ST-2的存活率略低，为74.68%，基本达到了75%。

图5 益生菌在模拟肠液中的耐受性Fig. 5 Tolerance of probiotics to simulated intestinal juice

2.3.6 益生菌经模拟唾液、胃液、肠液消化后的存活率

图6 益生菌经模拟唾液、胃液、肠液消化后的存活率Fig. 6 Tolerance of probiotics to simulated digestive juice

由图6可知，菌株编号为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在经过模拟唾液、胃液、肠液消化后生长状况良好，存活率分别为90.13%、88.62%、89.49%、88.27%，基本达到了90%左右，且各菌株之间差异很小，可以很好地在模拟环境中生存，至少存活24 h。

2.3.7 益生菌对HT-29细胞黏附性结果

2.3.7.1 cFDA-SE荧光标记结果

表4 cFDA-SE对益生菌菌体细胞的标记率Table 4 Labeling rate of cFDA-SE on probiotics

由表4可以看出，cFDA-SE对这4 株菌的标记率都很高，标记率均大于85%，其中菌株1.1881的标记率最高，为89.60%，且菌株1.1881、BLP12与ST-2、GS-3之间的菌体标记效果有显著性差异（P＜0.05），但不同菌体细胞标记率间的差值最大仅为2.8%，差值较小。

2.3.7.2 益生菌对HT-29细胞的黏附性

由图7可知，菌株编号为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株对HT-29细胞的黏附率各不相同。黏附率范围为1.31%～16.34%，其中菌株ST-2和1.1881的黏附率明显高于另外2 株菌，分别为16.34%、12.31%，能达到10%以上；而菌株GS-3（1.31%）、BLP12（1.93%）的黏附率很低，二者均未达到2.0%，与菌株ST-2和1.1881的黏附性有显著性差异（P＜0.05）。李清等[30]研究表明菌株对Caco-2细胞的黏附能力与其表面蛋白类物质及其他大分子物质有关，本实验4 株菌的细胞黏附性各不相同，原因可能与菌体的自聚集能力和表面疏水性存在较大的相关性，但由于所用细胞不一样，具体原因还需要进一步的实验。

图7 益生菌对HT-29细胞的黏附性Fig. 7 Adhesion of probiotics to HT-29 cells

2.3.8 主成分分析结果

将菌株ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的α-葡萄糖苷酶抑制率和其他特性进行整理和标准化处理，进行主成分分析，筛选出性能最优的降糖菌株。

图8 碎石图Fig. 8 Scree plot

表5 总方差分析Table 5 Total variance explained

表6 成分矩阵Table 6 Component matrix

图9 主成分分析结果Fig. 9 PCA loadings and scores plots

表7 因子得分结果Table 7 Analysis of principal component scores

如图8所示，优良菌株8 个特征值中有3 个特征值的数值大于1，故可以将分析的特性指标简化为3 个主成分。

由表5可知，第1主成分的方差贡献率为50.468%，第2主成分的方差贡献率为32.495%，第3主成分的方差贡献率为17.037%。第1主成分和第2主成分的累计贡献率达到了82.963%。说明进行分析的8 个特性可以简化为2 个主成分，可以解释所有特性的82.963%。

由表6可以看出每个主成分在所分析特性上的成分载荷。图9a是因子载荷图，是表6的直观表现，为各个特性在各主成分中占的载荷分布图。第1主成分可以解释5 个特性：其成分载荷分别为胃肠道转运性0.976、对模拟胃液的耐受性0.943、对模拟肠液的耐受性0.854、耐酸性0.751、对胆盐的耐受性0.721；第2主成分主要解释2 个特性：α-葡萄糖苷酶抑制率0.979、细胞黏附性0.934。

图9b是因子得分图，其展示了所选益生菌的分布，根据图9b和表7可以看出，菌株BLP12的综合得分最高，为51.42，明显高于其他3 种菌株，1.1881的综合得分最低。这一结果表明，BLP12可作为潜在的降糖益生菌株。

3 讨论与结论

本实验以实验室保藏的77 株益生菌为研究对象，从菌株的CFS和CFE分析益生菌对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以期筛选出能够通过抑制α-葡萄糖苷酶活性而发挥降糖作用的益生菌。结果表明，当菌株浓度为1×109CFU/mL时，多数菌株的CFS对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，并且有7 株益生菌的抑制率达到了10%及以上，抑制作用明显，而77 株益生菌的CFE对α-葡萄糖苷酶未呈现抑制作用。Zeng Zhu等[19]研究发现，当菌液的浓度为1×1010CFU/mL时，L. rhamnosus GG的CFS对α-葡萄糖苷酶的抑制率为28.3%，CFE抑制率为2.5%；L. plantarum ZF06-3的CFS对α-葡萄糖苷酶的抑制率为34.9%，CFE没有抑制作用等，总体结果中有少数几株菌的CFE也没有检测到抑制作用，说明多数菌株的CFS提取物中含有抑制α-葡萄糖苷酶活性的物质。陈佩等[13]研究发现当菌液浓度为1×109CFU/mL时，干酪乳杆菌CCFM0412的培养上清液具有较好的α-葡萄糖苷酶活性的抑制率（29.61%）及较高的抗氧化能力。本实验筛选得到的最优菌株为BLP12，其CFS的α-葡萄糖苷酶抑制率为15.101%，与Zeng Zhu等[19]的结果相比其抑制率较低，但菌液浓度也很低，随着菌液浓度的增大，菌株BLP12抑制活性也会增加；与陈佩等[13]的研究相比，因提取物制备方法不同，抑制率低于其所选的最优菌株。筛选得到具有较强α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株编号为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12，经鉴定为干酪乳杆菌和植物乳杆菌，与目前报道的多数具有降糖作用益生菌的种属关系一致。

为了保证所选益生菌的降糖功能有效发挥，对菌株进行益生特性的评价。在耐酸性实验中，编号为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的4 株菌在pH 3.0的条件下均存活性良好，在pH 2.0的条件下，仅菌株1.1881对酸表现为敏感；在对胆盐的耐受性实验中，在高浓度2.0%的胆盐浓度下，4 株菌的存活率不一，其中菌株ST-2对胆盐的耐受性最好，能达到1.63%，活菌数为2.86×107CFU/mL；在对HT-29细胞的黏附性实验中，各菌株间出现了差异，菌株ST-2和1.1881的黏附率明显高于菌株GS-3和BLP12。

本实验为了更加真实地模拟人体消化道环境，根据Versantvoort等[25]方法配制了消化液，其中不仅含有胰蛋白酶、胃蛋白酶，还含有黏蛋白酶II、III，溶菌酶等，此外添加了各种无机盐（KCl、MgCl2、NaH2PO4等）。在模拟唾液中，菌株ST-2、1.1881、GS-3、BLP12均表现状况良好，生长未受到影响；在pH 2.0的模拟胃液孵育3 h时，菌株ST-2、GS-3、BLP12在pH 2.0培养液条件下的存活率均大于在模拟胃液中的存活率，可能是由于模拟胃液中的胃蛋白酶对其产生了抑制作用；在模拟肠液中，4 株菌株表现出了很好的耐受性，存活率均能达到75%及以上，原因可能是本实验中的人工模拟肠液添加了牛血清蛋白和黏蛋白，黏蛋白可以作为细菌的营养物质提供碳源[31]，同时模拟肠液中未添加胆盐，这些都会导致菌体在模拟肠液中存活率有所提高。且供试菌株在经口腔、胃肠道连续消化约1 d后，存活率基本能达90%，其中菌株1.1881、GS-3、BB12在连续消化后的存活率高于在模拟胃液中的存活率，这可能是模拟肠液中含有促进菌株生长的生长因子（黏蛋白），因此各菌株在经过模拟唾液、胃液和肠液连续消化后的存活率会很高，使其能够很好地对宿主发挥作用。

本研究所筛选出具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株为ST-2、1.1881、GS-3、BLP12，其益生特性均各有特色和不足。利用主成分分析对包括α-葡萄糖苷酶抑制率及各种模拟体内环境的益生特性进行综合评估结果显示，菌株BLP12的得分最高，可以很好地通过消化道的各种屏障而发挥其降糖功能。本实验筛选到降糖菌株后，下一步将会对BLP12进行动物喂养实验，进一步验证其降糖效果。