T4 DNA聚合酶在大肠杆菌中高效表达、纯化及部分生物学活性分析

付大伟，陈启蒙，孙莹莹，徐 伟

T4 DNA聚合酶（T4 DNA polymerase，T4 DP），是由T4噬菌体的基因编码的一种模板依赖的DNA聚合酶[1]，同时具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’DNA外切酶活性[2]，可以用于将5’端突出末端补平或3’端突出末端削平，使克隆载体末端平滑化[3-5]，是基因工程技术中一种重要的工具酶。

目前，市场所售的许多DNA末端平滑化试剂盒中的主要作用酶是T4 DP，虽然其可快速补平基因的黏性末端，但也存在问题：末端平滑化的目的片段需电泳和胶回收后才可进行连接反应，这使得构建重组载体的操作变得繁琐，DNA损失量较大，影响连接效率，所以把末端平滑化反应与连接反应相结合成为现今急需解决的问题。

ccdB致死基因可编码一种使细菌中促旋酶失活的毒素蛋白CcdB，从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长[6]。在重组克隆载体构建过程中，当外源基因成功插入到含ccdB基因的克隆载体中会影响ccdB基因的正常翻译，从而无法正确表达毒素蛋白CcdB，含有重组子的菌株可以正常生长；当外源基因片段未插入到含ccdB基因的克隆载体中，克隆载体自连后致死基因正确表达，包含自连空载体的宿主无法存活，即低背景。用这种阳性筛选策略可以提高阳性重组率，加速阳性克隆筛选进程[7-9]。

目前较通用的蛋白纯化方法是Ni柱纯化法[10]，但其存在操作程序繁琐、时间较长、介质昂贵、纯化量少等问题，只适应于实验室规模的小量样品制备[11]。与传统Ni柱纯化法相比较，近几年兴起的MagNi磁珠纯化法更具有优势，MagNi磁珠是高均一性的磁性微球，其表面包被Ni＋，可与带有His标签的重组蛋白充分特异性结合，使其从混合溶液中分离出来[12-14]。其主要特点有：1）操作简单、成本低廉；2）分离速度快、效率高、可重复性好；3）特异性强、纯化量大，可应用于大规模生产基因工程重组蛋白；4）不影响重组蛋白活性与功能。

本研究将构建的pET-22b（＋）-T4 dp表达载体在Transetta（DE3）中进行了自诱导表达[15-16]，并对诱导条件进行了优化。分别采用MagNi磁珠法与传统Ni柱法对自诱导表达的T4 DP进行纯化，分析两种方法的纯化效果。使纯化后的T4 DP应用于末端平滑化反应，并与T4 DNA连接酶协同作用于低背景克隆载体的构建中，旨在研究出一种新的DNA末端平滑化连接方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

Transetta（DE3） 北京全式金生物技术有限公司；TransI菌株、pET-22b（＋）质粒由本实验室保存。

HiFi DNA Polymerase、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BamHI、NotI、T4 DP、快速末端平齐化™试剂盒美国NEB公司；一步法克隆试剂盒 南京诺唯赞生物科技有限公司；异丙基硫化-β-半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG） 美国Sigma公司；筛选用的氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cmr）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、Triton X-100、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、DNA Blunting 宝生物工程（大连）有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒和小量质粒回收试剂盒美国Omega公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow亲和层析柱美国GE公司；预染蛋白质Marker 美国Thermo公司。

LB培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0；LB固体培养基需加入琼脂粉18 g/L。SOB培养基：蛋白胨20 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 0.5 g/L、2.5 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2、琼脂粉18 g/L。

1.2 仪器与设备

T100TMThermal Cycler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；DYY-6C型电泳仪 北京六一仪器厂；H1650-W台式离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；GDS8000凝胶成像系统 美国UVP公司；W201B恒温水浴锅上海申胜生物技术有限公司；DW-86L388A立式超低温保存箱 青岛海尔特种电器有限公司；DHP-9162恒温培养箱、HZQ-311C落地恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 T4 dp基因的扩增

根据T4 DP的基因在Genbank数据库中报道的序列（U34036）及所需载体的基因序列来设计引物，在上、下游引物的5’端分别加入了BamHI和NotI酶切位点。上游引物P1：5’-GGCGATGGCCATGCGGATTCGATGAAAGA ATTTTATATCTCTATTGAAACAGTCG-3’，下游引物P2：5’-GTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCGCCAAACAGGAAG TCTAACGAAGC-3’（下划线代表酶切位点），引物送至上海生工生物有限公司进行合成。以提取的T4噬菌体的基因组为模板，PCR扩增获得T4 dp的基因，利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。

1.3.2 重组表达载体的构建

通过一步法将纯化产物与经BamHI和NotI酶切后的pET-22b（＋）表达载体连接，构建重组质粒pET-22b（＋）-T4 dp[17]，并直接转化到 E. coli TransI克隆感受态细胞中，通过菌落PCR及酶切鉴定筛选出阳性菌，并将其送到上海生工生物有限公司进行序列测定。

1.3.3 自诱导和IPTG诱导重组质粒pET-22b（＋）-T4 dp表达的比较分析

将测序成功的重组质粒pET-22b（＋）-T4 dp转化到Transetta（DE3）表达感受态细胞中，涂布于含Amp及Cmr的LB平板上，37 ℃培养过夜。挑取单菌落培养过夜，按1‰的接种量分别接种于10 mL含Amp及Cmr的ZYP（1 g/100 mL酸水解酪素＋0.5%酵母提取物＋磷酸盐）＋5052自诱导培养基和LB培养基中，分别进行自诱导[18-19]及IPTG诱导表达[20]。取样分别进行菌体密度及10 g/100 mL的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.4 磁珠法检测T4 DP表达的可溶性分析

取1.3.3节中1 mL自诱导培养的菌液，离心收集菌体，按MagNi Protein Purification Kit的说明书进行纯化检测T4 DP的可溶性。对沉淀、上清液、穿透液、洗脱液进行SDS-PAGE分析。

1.3.5 重组蛋白T4 DP的自诱导表达条件的优化

1.3.5.1 自诱导温度的优化

将菌液按1‰的接种量分别接种于4 管10 mL ZYP＋5052自诱导培养基中，37 ℃培养至OD600nm值约为0.2时，分别放置于16、20、25、30 ℃培养至OD600nm值约为1.5时，收集菌体，依据1.3.4节方法进行可溶性T4 DP的纯化检测及SDS-PAGE分析。

1.3.5.2 自诱导时间的优化

将菌液按1‰的接种量接种于20 mL含Amp及Cmr的ZYP＋5052自诱导培养基中，30 ℃振荡培养4、5、6、7、8、9、10、12、14、16 h时，收集菌体进行SDSPAGE分析。

1.3.6 不同裂解菌体方法的比较

将菌液按1‰的接种量接种于300 mL含Amp及Cmr的ZYP＋5052自诱导培养基中，30 ℃振荡培养10 h，以100 mL每管分装于1、2、3号管中，离心收集菌体。向1号管中加入结合缓冲液悬浮菌体，冰浴超声裂解细胞[21]；向2号管中加入结合缓冲液、终质量浓度1 mg/mL的溶菌酶、10 mmol/L PMSF及终质量分数为1%的Triton-X 100充分混匀，冰浴30 min，超声破碎[22]；向3号管中加入0.2 mg/L多黏菌素B、50 mmol/L pH 7.5 Tris-HC1、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF及100 μL DNaseI溶液悬浮菌体[23]，间歇振荡20 min。分别离心收集3 个管中的上清和沉淀进行SDSPAGE分析比较。

1.3.7 Ni柱和MagNi磁珠纯化效果的比较

1.3.7.1 Ni SepharoseTM6 Fast Flow亲和层析柱纯化分析

按GE的Ni Sepharose 6 Fast Flow说明书的操作进行纯化，取样进行SDS-PAGE分析。1.3.7.2 MagNi磁珠纯化分析

将1.3.5节中3号管破碎后收集的上清液按1.3.4中方法进行大量纯化，收集样品进行SDS-PAGE分析。

1.3.8 纯化后T4 DP质量浓度的测定

用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）20000包埋法对1.3.7.2节中Ni柱和MagNi磁珠纯化后的T4 DP进行浓缩，经脱盐柱脱盐以除去咪唑，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定洗脱液中T4 DP质量浓度，加入storage buffer，－20 ℃保存。

1.3.9 纯化后的T4 DP在重组克隆载体中的应用

1.3.9.1 T4 DP的末端平滑化活性检测

配制末端平滑化连接反应体系，在反应体系中加入10 µL 5×T4 DP Buffer，38 μL EcoRV、HindIII双酶切pET-32a，0.2 μL待测的T4 DP，0.5 μL 100 μg/mL BSA，2.5 μL dNTPs。反应体系中以ddH2O代替待测酶设为空白对照，以其他公司购买的T4 DP作对照。轻轻混匀，12 ℃反应15 min，1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收后进行连接反应。在连接反应体系中加入2 µL 5×T4 DNA连接酶Buffer，8 μL胶回收产物，0.5 μL T4 DNA连接酶，25 ℃反应30 min。转化到E. coli TransI克隆感受态细胞中，涂布于含Amp的SOB固体培养基中，37 ℃培养过夜，观察菌落数，菌落PCR检测其阳性克隆率。

1.3.9.2 T4 DP在低背景重组载体构建中的应用

以EcoRV单酶切的pUC19-ccdB载体为克隆载体，以EcoRI和NotI双酶切的T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 pnk）基因片段为目的片段，配制连接反应体系。在连接反应体系中加入10 µL 5×T4 DNA连接酶Buffer、34 μL EcoRV单酶切的pUC19-ccdB、4 μL EcoRI和NotI双酶切后的T4 pnk基因片段，25 ℃反应15 min，置冰上2 min，与其他公司的DNA Blunting Kit作对照，按1.3.9.1节方法进行转化，培养及检测。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增

以T4噬菌体基因组为模板经PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳显示在约2 697 bp处有一条清晰带（图1），与预期目的片段大小一致。

图1 PCR扩增T4 dp基因Fig. 1 PCR amplification of T4 dp gene

2.2 重组质粒的鉴定

2.2.1 菌落PCR

经一步法构建重组载体pET-22b（＋）-T4 dp，转化到E. coli TransI中，用含Amp及Cmr的LB固体培养基筛选阳性菌落，用1.3.1节中的P1 Primer和T7 ter对挑取的6 个菌落进行菌落PCR检测，1%琼脂糖凝胶电泳中约2 740 bp处有明显条带，与预期目的片段大小一致（图2），但以空载体为阴性对照无目的条带，说明目的条带成功插入pET-22b（＋）表达载体中。

图2 菌落PCR鉴定pET-22b（＋）-T4 dp重组质粒Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pET-22b(+)-T4 dp by PCR

2.2.2 酶切鉴定

取菌落PCR检测成功的菌株进行培养，按GenElute™Plasmid Miniprep Kit进行质粒的提取，对其进行BamHI和NotI双酶切，以重组质粒为阴性对照，1%琼脂糖凝胶电泳检测，可看到约2 697 bp和约5 370 bp处有两条条带（图3），与预期大小基本符合。利用NCBI中的BLAST程序，将测序的结果与GenBank中所查基因序列进行比对，相似性达98%，成功构建重组质粒pET-22b（＋）-T4 dp。

图3 双酶切鉴定pET-22b(+)-T4 dp重组质粒Fig. 3 Identification of recombinant plasmid pET-22b(+)-T4 dp by double enzyme digestion

2.3 自诱导和IPTG诱导重组质粒pET-22b（＋）-T4 dp表达的比较分析

将重组菌Transetta（DE3）/pET-22b（＋）-T4 dp分别进行自诱导及IPTG诱导表达。菌体密度OD600nm值分别为4.5与1.3。SDS-PAGE分析显示，诱导都产生特异性条带，其分子质量约104 kDa，与预期大小基本相符（图4），Bandscan分析表达量分别为50.8%与25.7%。由此可见，自诱导不仅可提高细胞生长密度，而且提高单位细胞中蛋白表达量，诱导效果更显著，因此选用自诱导培养基诱导更合适。

图4 T4 DP诱导表达的SDS-PAGE分析Fig. 4 The SDS-PAGE profile of induced expression of T4 DP

2.4 磁珠法检测T4 DP表达的可溶性分析

图5 T4 DP可溶性表达的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE profile of T4 DP expressed in a soluble form

对上述自诱导后收集的1 mL菌液进行纯化检测其可溶性，SDS-PAGE分析显示，菌体破碎后上清液中有较多T4 DP，但沉淀和穿透液有T4 DP（图5），说明表达的T4 DP有包涵体存在，这可能是因为大肠杆菌中外源基因快速大量表达目的蛋白时出现了错误性折叠，从而形成失活的包涵体[24]，需要对诱导条件进一步优化，以提高T4 DP的可溶性。

2.5 重组蛋白T4 DP的自诱导表达条件的优化

2.5.1 自诱导温度的优化

诱导温度不仅影响菌体的生长，同样影响着重组蛋白的诱导表达及蛋白的可溶性。低温诱导可以有助于蛋白的可溶性表达[25]。SDS-PAGE显示，在30 ℃条件下形成的包涵体相对较少，表达量最高。所以最佳诱导温度为30 ℃（图6）。

图6 温度对可溶性T4 DP质量浓度的影响Fig. 6 Effects of induction temperature on the solubility of T4 DP

2.5.2 自诱导时间的优化

在30 ℃条件下进行自诱导培养4、5、6、7、8、9、10、12、14、16 h时，分别取样检测，SDS-PAGE显示，未诱导的菌体不表达目的蛋白，诱导后菌体表达量随时间延长而增加（图7），在诱导10 h时，T4 DP表达量最高，同时菌体内的蛋白酶对重组蛋白的降解也会增加，所以过长时间的诱导对重组蛋白的表达同样不利，随后T4 DP的表达量有所减少，所以最佳诱导时间为10 h。

图7 诱导表达时间对T4 DP表达的影响Fig. 7 Effects of induction time on the expression of T4 DP

2.6 3 种裂解重组菌方法的比较

图8 不同裂解重组菌体方法的比较Fig. 8 Comparison of recombinant bacteria disintegrated by different methods

分别采用超声波法、超声波-溶菌酶法、化学裂解法对100 mL菌体进行破碎。SDS-PAGE显示，在相同菌体量的条件下，化学裂解法破碎菌体较为完全，上清液中的T4 DP含量较多，所以采用化学裂解法裂解重组菌效果好（图8）。

2.7 Ni柱和MagNi磁珠纯化效果的比较

2.7.1 Ni SepharoseTM6 Fast Flow亲和层析柱纯化

取10 mL 1.3.6节中3号管裂解的上清液进行亲和层析纯化。SDS-PAGE显示，纯化后的洗脱液有一条清晰条带，其大小与预期的T4 DP相同，但并不是单一条带，且穿透液及漂洗液中都含有T4 DP，说明T4 DP纯化量少，且纯化程度不高（图9）。

图9 Ni Sepharose 4B亲和层析柱纯化T4 DP的SDS-PAGE分析Fig. 9 SDS-PAGE analysis of T4 DP purified by Ni Sepharose 4B affinity column

2.7.2 MagNi磁珠纯化

取10 mL上述3号管裂解后上清液进行亲和层析纯化，SDS-PAGE显示，虽穿透中有少许T4 DP，但纯化后的洗脱液仅有一条清晰条带，其大小与预期的T4 DP相同。由于MagNi磁珠是一种表面包被Ni＋的磁性微球，可悬浮于裂解液中，从而增加特异性结合面积，所以MagNi磁珠法纯化程度较高，纯化量较大，纯化效果较好（图10）。

图10 MagNi磁珠纯化 T4 DP的SDS-PAGE分析Fig. 10 SDS-PAGE analysis of T4 DP purified by MagNi magnetic beads

2.8 纯化后的T4 DP质量浓度测定

分别对Ni柱和MagNi磁珠纯化后的T4 DP进行浓缩、脱盐，采用BCA法测定T4 DP质量浓度分别为539.29、3 073.960 μg/mL。

2.9 纯化的T4 DP在重组克隆载体中的应用

2.9.1 T4 DP的末端平滑化活性检测结果

对EcoRV、HindIII双酶切的pET-32a进行平末端化及连接反应，重新构建载体。如表1所示，酶切的pET-32a产物没有经过末端平滑化反应，末端不匹配，则无法进行连接反应，所以无重组菌生长。与A公司及B公司购买的T4 DP进行对比，纯化的T4 DP菌落生长数较多，PCR检测其阳性克隆率最高，说明该酶的末端平滑化活性较好。

表1 T4 DP的末端平滑化活性检测结果Table 1 Terminal blunting activity of T4 DP obtained from different companies

2.9.2 T4 DP在低背景重组载体构建中的应用

以EcoRV单酶切的pUC19-ccdB载体为克隆载体，以EcoRI和NotI双酶切后的T4 pnk基因片段为目的片段，通过末端平滑化连接方法构建重组载体pUC19-ccdB-T4 PK。pUC19-ccdB载体中含有ccdB基因，当连接反应不加入T4 DP时，目的片段末端不能平滑化，无法插入到克隆载体中，从而使克隆载体自连抑制宿主细胞生长，所以无菌体生长（表2），说明pUC19-ccdB载体有良好的筛菌作用。与其他公司的试剂盒比较，本研究菌落数较多，阳性克隆率高，说明低背景克隆载体平滑化连接方法具有可行性与高效性。

表2 末端平滑化试剂盒的比较Table 2 Comparison of terminal blunting kits from different companies

3 结 论

本研究以提取的T4噬菌体基因组为模板，根据GenBank上已发表的来源于T4噬菌体的RB69 DNA polymerase（gene 43）基因序列来设计引物，扩增得到长度为2 697 bp的T4 dp序列，编码851 个氨基酸。在BLAST上进行比对，与上述所查基因序列相似性达98%。使其插入到 pET-22b（＋）质粒中构建重组表达载体，转化到Transetta（DE3）表达宿主中进行自诱导及IPTG诱导表达，与IPTG诱导相比，自诱导表达使菌体密度增加到4 倍左右，T4 DP表达量增加到2 倍左右。通过优化得出最佳自诱导条件：30 ℃培养10 h。MagNi磁珠纯化获得大量高纯度T4 DP，经BCA法检测其质量浓度为3 073.960 μg/mL，与Ni柱纯化的T4 DP相比，其质量浓度提高到Ni柱的5.7 倍。分别利用MagNi磁珠纯化获得的T4 DP及其他公司的T4 DP进行克隆载体的构建，检测的菌落数及阳性克隆率都较高，证明其具有较好的末端平滑化的作用。最终使其应用于低背景克隆载体平滑化连接方法中，阳性克隆率达97.92%，证明该方法具有可行性和高效性。

为增加可溶性T4DP的表达量，本实验采取3 种手段：1）选择自诱导表达T4 DP。马闪闪等[20]研究表明自诱导表达可使CBM2蛋白表达量提高2 倍，其菌体密度提到4.4 倍。本实验采用自诱导培养基进行诱导表达，也使重组菌的菌体密度及T4 DP的表达量得到了显著提高。2）选择能够补充大肠杆菌缺乏的8种稀有密码子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA）对应的tRNA的E.coli Transetta（DE3）作为宿主菌，促进外源基因的可溶性表达[26-27]。3）优化诱导表达条件，通过预实验发现对重组菌表达量影响较大的因素是温度与时间，对其进行优化以确定最佳诱导条件。除了以上方法，仍有许多在实验中成功提高蛋白可溶性的方法，如使用分子伴侣、增加融合标签或选择不同宿主细胞等[28-30]，但由于蛋白质种类繁多、性质各异，目前还没有一个可以提高可溶性表达的通用方法，所以最佳表达可溶性T4DP的方法还有待进一步深入研究。

本实验通过Ni柱和MagNi磁珠纯化效果的比较，证明MagNi磁珠纯化具有操作简单、结合量大、纯化效果好等特点，在重组蛋白分离纯化中有良好的应用前景。但本研究还需对MagNi磁珠法的纯化条件及对重组酶活性的影响做进一步探究，以确定最佳纯化方案。

虽然本研究构建了一种低背景克隆载体末端平滑化连接方法，但只是对该方法进行了初步研究。本课题组还需对该方法中的反应体系和反应条件进一步优化，有望实现其在分子生物技术等领域的应用。