毛细管区带电泳-红色激光诱导荧光检测磷酸化氨基酸

夏丽君， 郭小峰， 王 红

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

蛋白质磷酸化是一种重要的蛋白质修饰类型，在真核生物细胞增殖和分化、细胞凋亡、基因表达、信号传导以及新陈代谢等细胞调控过程中起到关键作用[1-2]，其失调与癌症、糖尿病和高血压等[3]许多疾病有关。最常见的磷酸化类型为苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基的磷酸化，它们具有作为控制蛋白质-蛋白质相互作用的分子开关的能力[4]。蛋白质的水解和生物体代谢活动可生成对应的磷酸化氨基酸，通过对它们的定量分析，可以了解蛋白质磷酸化程度，并探讨磷酸化对蛋白质功能的影响[5]。

目前，已有多种磷酸化氨基酸的分析方法，如薄层色谱法[6]、同位素标记法[7]、高效液相色谱法(HPLC)[8]、毛细管电泳法(CE)[5]和液相色谱-质谱法(LC-MS)[2]等。其中，CE不仅灵敏度高、分离速度快，且样品消耗量远少于其它方法，特别适合生物样品的分析。但是，磷酸化氨基酸本身不具备可检测的荧光信号，需要使用荧光衍生试剂。已报道的用于检测磷酸化氨基酸的荧光衍生试剂主要有：荧光素异硫氰酸酯(FITC)[9]、2,3-萘二醛(NDA)[10]、9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC)[11]、6-氧-(N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯)-9-(2′-甲氧羰基)荧光素(SAMF)[12]、1-(ε-琥珀酰亚胺羧戊基)-1′-甲基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚碳菁-5,5′-二磺酸单钾盐(MeCy5-OSu)[5]、N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯(SIFA)[13]、3-(2-呋喃甲酰基)喹啉-2-甲醛(FQ)[14]和5-(4,6-二氯-s-三嗪-2-氨基)荧光素(DTAF)[15]等，它们均通过与磷酸化氨基酸上的氨基反应实现荧光标记。

1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(4′-氧乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯)-二氟化硼-二吡咯甲烷(DMDSPAB-OSu)是本课题组近期自行设计并合成的氨基荧光衍生试剂，其结构见图1。……