乳酸细菌内毒素检查方法研究

马云艳

【摘 要】根据《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查法要求，建立乳酸细菌内毒素检查方法。通过预干扰试验，确定乳酸最终浓度为0.4mg/ml以下，选取浓度为0.2mg/ml，对鲎试剂与细菌内毒素之间的聚集反应无干扰作用。故该方法可作为乳酸的细菌内毒素检查方法使用。

【关键词】乳酸；细菌内毒素检查

乳酸纯品为无色液体，无气味，具有吸湿性，能与水、乙醇、甘油混溶。在食品、医药、工业、化妆品、农产品及农业等领域广泛应用。本文中乳酸作为地佐辛注射液及雷莫司琼注射液的药用辅料使用，选用湛江安度斯生物有限公司生产的鲎试剂进行预干扰试验，然后用两个鲎试剂生产厂家即湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司，分别进行干扰试验。通过本试验研究了解乳酸对细菌内毒素试验的适用性，为制剂质量标准制定细菌内毒素检查项提供试验依据。

一、仪器及试验试剂

（一）仪器

内毒素凝胶法测定议

漩涡混合器

移液器

（二）试剂、无热原吸头

细菌内毒素工作标准品 10EU/ml 批号：1704260 购自湛江安度斯生物有限公司

细菌内毒素检查用水 内毒素含量<0.003EU/ml 批号：1703030购自湛江安度斯生物有限公司

鲎试剂 0.25EU/ml 批号：1704102购自湛江安度斯生物有限公司

鲎试剂 0.25EU/ml 批号：1608110购自湛江博康海洋生物有限公司

鲎试剂 0.125Eu/ml 批号：1609200购自湛江安度斯生物有限公司

鲎试剂 0.06Eu/ml 批号：1608012购自湛江安度斯生物有限公司

稀释剂Ⅱ 批号：1701120购自湛江安度斯生物有限公司

无热原吸头（250ul） 批号： 1702280购自湛江安度斯生物有限公司

无热原吸头（1000ul） 批號： 1612130购自湛江安度斯生物有限公司

（三）样品信息

乳酸 批号171001 无锡某制药有限公司

二、细菌内毒素检查方法

（一）细菌内毒素限值的确定

依据地佐辛注射液说明书的用法用量计算乳酸限值（10EU/mg），雷莫司琼注射液说明书的用法用量计算乳酸限值（75EU/mg）综合考虑，以最小值取四倍安全系数，确定乳酸细菌内毒素限值为2.5EU/mg。

（二）鲎试剂灵敏度符合

按照《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂灵敏度符合，结果均符合规定。

（三）预试验

1.试验过程

现有的鲎试剂浓度为0.25Eu/ml、0.125Eu/ml、0.06Eu/ml。乳酸有效稀释浓度（MVC）范围按公式MVC=λ/L，L=2.5Eu/mg。计算可知，乳酸最低有效浓度为0.024～0.1mg/ml。选取0.25Eu/ml的鲎试剂进行预干扰试验。

取1ml乳酸称重约为1.2g，即为1200mg/ml的供试品原液，以稀释剂Ⅱ对供试品原液进行稀释，将此系列浓度记为S。同时在上述溶液中加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的溶液中均含0.5Eu/ml浓度的细菌内毒素，将此系列溶液记为SE，取鲎试剂0.25EU/ml与上述相应S和SE反应，每一浓度重复做两管，并设阳性和阴性对照。根据试验结果，在S均为阴性，阳性、阴性对照为阳性和阴性的情况下，选取开始出现阳性的SE所对应浓度的下一级浓度为MVC。结果如下：

通过预干扰试验，在浓度为0.4mg/ml下无干扰，选取下一浓度，即0.2mg/ml为不干扰浓度进行试验。

（四）正式干扰实验

为了最终确认是否存在干扰因素的影响，进行以下正式干扰试验。取供试样品用稀释剂Ⅱ进行稀释，使其最终无干扰试验稀释浓度为0.2mg/ml，按《中国药典》2015年版四部通则1143中的“细菌内毒素检查法干扰试验项”进行试验。

结果如下：

鲎试剂厂家：湛江博康海洋生物有限公司 λ=0.25EU/ml

鲎试剂厂家： 湛江安度斯生物有限公司 λ=0.25EU/ml

正式干扰试验结果表明：0.2mg/ml稀释液对Et均在0.5ES～2.0ES范围内，确认无干扰影响。

（五）供试品细菌内毒素检测

按《中国药典》2015年版四部通则1143中“细菌内毒素检查法”使用两个厂家的鲎试剂分别对供试品进行细菌内毒素检查，结果均符合规定。

三、讨论

（一）通过预干扰试验结果表明，湛江安度斯生物有限公司生产的鲎试剂与供试品在0.4mg/ml稀释液以下浓度范围内反应无干扰作用。

（二）正式干扰试验选用0.2mg/ml供试品稀释液，与两个厂家的鲎试剂反应结果Et均在0.5ES～2ES范围内，确认无干扰影响。内毒素限值若为2.5EU/mg，则稀释液浓度在0.2mg/ml以下，一般不会产生干扰影响，可以完成正常检测。

（三）细菌内毒素表述为：取本品，依法检查（《中国药典》2015年版四部通则1143），每1mg乳酸中含内毒素的量应小于2.5EU。