朱顶红染色体核型分析及倍性鉴定

李 心,张永春,姜红红,孙 翊,李青竹,杨柳燕

(上海市农业科学院林木果树研究所,上海201403)

朱顶红为石蒜科朱顶红属(HippeastrumHerb.)多年生球根花卉,是本属原生种和现代改良园艺杂交种的总称[1-2]。朱顶红原产于南美洲,17世纪传入欧洲和北美,20世纪初引入中国,目前全球约有75个原生种和超过600个园艺品种[3-4]。朱顶红花大色艳,形态优美,观赏价值极高,不仅可以作为重要的盆栽和切花材料,还可以作为露地景观栽植,具有极其广泛的应用价值[5]。

植物细胞染色体的观察与分析技术是细胞遗传学一项基本技术,多被应用于染色体核型分析[6-7]、倍性鉴定[8-9]等生物学领域。针对染色体形态进行的核型分析有助于了解生物的遗传物质组成、变异规律、物种起源、进化关系等,在细胞分类学、染色体工程、品种间亲缘关系鉴定中具有重要地位[10]。依据染色体计数进行的倍性鉴定方法是目前最直接、最可靠、应用最广泛的鉴定方法,在辅助植物杂交育种研究和植物遗传学研究中具有重要的应用价值[11]。

迄今为止,国内外鲜见关于朱顶红染色体制片技术及核型分析的报道。1994年,邹琦丽等[12]通过对朱顶红原生种‘线缟华胄’(H.rutilum)的染色体核型分析,发现其染色体数目为33条,核型公式为K(2n)=3x=33=12 m+9 sm+12 st,被鉴定为三倍体朱顶红。2013年,陈瑞娇[13]通过0.1%秋水仙素溶液预处理朱顶红根尖进行常规压片,对白肋朱顶红(H.reticulatumvar.striatifolium)进行染色体制片,核型分析结果表明,白肋朱顶红的染色体数目为22条,核型公式为K(2n)=2x=8 m+6 sm+8 st,核型不对称系数(As.K)为69.96%,核型类型为3B型,被鉴定为二倍体朱顶红。

本试验以朱顶红新生根尖为材料,通过低温与8-羟基喹啉水溶液相结合的预处理方法和HCl解离对朱顶红的染色体制片技术进行进一步的研究,并首次对朱顶红园艺品种‘柠檬冰糕’(‘Lemon Sorbet’)进行了染色体核型分析。同时,依据染色体计数结果对6个朱顶红商业品种‘凤蝶’(H.papilio)、‘特伦蒂诺’(‘Trentino’)、‘粉色惊奇’(‘Pink Surprise’)、‘快车’(‘Rapido’)、‘苹果花’(‘Apple Blossom’)、‘樱桃妮芙’(‘Cherry Nymph’)细胞水平进行倍性鉴定,以期为朱顶红属资源多样性研究、新品种选育、亲本选配等奠定细胞遗传学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

取9℃冷藏处理后的朱顶红开花球,于2015年12月种植于上海市农业科学院花卉基地塑料大棚中,待长出新根后,取新根用于染色体制片。

1.2 方法

切取朱顶红品种‘柠檬冰糕’新生根尖1 cm左右为试验材料,取样时间为上午9：00—10：00;4℃条件下,用0.002 mol∕L 的8-羟基喹啉水溶液对根尖材料分别进行不同时间(1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h)的预处理;预处理后的根尖用蒸馏水清洗后置于卡诺氏固定液中,4℃固定12—24 h;蒸馏水清洗后可暂存于70%酒精中;之后取出根尖用蒸馏水清洗,在60℃条件下用1 mol∕L HCl水溶液进行解离处理,时间分别为6 min、9 min、12 min;清洗后在蒸馏水中低渗30 min;用刀片切除根冠后,再切取1 mm根尖于载玻片上,捣碎后滴加卡宝品红染色液染色10—20 min;常规压片后镜检并于100倍油镜下拍照。探索到合适的条件后,以同样的方法对‘凤蝶’‘特伦蒂诺’‘粉色惊奇’‘快车’‘苹果花’‘樱桃妮芙’进行染色体制片。

根据染色体制片结果,对朱顶红品种‘柠檬冰糕’进行核型分析,并通过染色体计数对‘凤蝶’‘特伦蒂诺’‘粉色惊奇’‘快车’‘苹果花’‘樱桃妮芙’进行倍性鉴定。

核型分析根据李懋学等[14]制定的标准进行,使用ImageJ图像处理软件进行染色体配对、排列、测量等。染色体类型分类根据Levan等[15]的方法进行,核型不对称系数采用Arano[16]的方法计算。核型类型根据Stebbins[17]的方法划分。相关公式为：

臂比(L∕S)=长臂(L)∕短臂(S);

染色体相对长度=染色体长度∕染色体组总长度×100%;

核型不对称系数(As.K)=长臂总长∕染色体组总长度×100%。

2 结果与分析

2.1 染色体制片

2.1.1 预处理时间

随着0.002 mol∕L 8-羟基喹啉水溶液预处理时间的增加,染色体逐渐缩短,细胞质浓度逐渐降低,染色体分散程度越来越好(图1)。其中1 h、3 h、6 h预处理后,染色体虽渐渐缩短,但仍然未浓缩到一定程度,相互缠绕现象严重;而9 h、12 h、24 h预处理后,染色体缩短程度基本相差不明显,且分散程度良好,结构清晰,因此在朱顶红染色体制片中,选用9—24 h预处理时间较为合适。

2.1.2 解离时间

使用1 mol∕L的HCl溶液解离6 min后,细胞分散效果良好,染色清晰,但染色体酸解程度不够,相互缠绕现象严重,无法进行染色体相关分析;解离12 min后,细胞分散较好,但染色体过度酸解,结构已受到破坏,着色较淡,同样无法进行分析;而9 min的解离时间相对适宜,细胞分散良好,染色体酸解适当,着色良好,结构清晰(图2)。

图1 不同预处理时间下的染色体形态Fig.1 Chromosome morphology under different pretreatment time

图2 不同解离时间下的染色体形态Fig.2 Chromosome morphology under different dissociation time

2.2 核型分析

在‘柠檬冰糕’染色体制片图中,选择30个染色体分散良好的细胞进行计数,所有染色体数目均为33条,占计数细胞的比例为100%,因而确定‘柠檬冰糕’的染色体数目为2n=33。选择染色体形态清晰、分散较好的分裂相进行染色体长短臂测量,根据染色体长度由长至短进行配对、排列和编号(表1、图3—5)。

表1 ‘柠檬冰糕’染色体参数Table 1 Chromosome parameters of‘Lemon Sorbet’

根据配对结果确定‘柠檬冰糕’为三倍体朱顶红品种,其染色体数目为2n=3x=33,具有3个染色体组,染色体基数为11。

核型分析结果表明,‘柠檬冰糕’核型公式为K(2n)=3x=33=12m+12sm+9st。其中1、2、3、4号为近中部着丝粒染色体(sm);5、6、7号为近端部着丝粒染色体(st);8、9、10、11号为中部着丝粒染色体(m)。染色体的相对长度变化范围为5.50%—12.60%,臂比的变化范围为1.13—3.85,最长染色体与最短染色体长度比为2.29。核型不对称系数(As.K)为70.19%。臂比大于2∶1的染色体所占比例为63.64%,根据Stebbins的核型分类标准,‘柠檬冰糕’核型类型为3B型。

图3 ‘柠檬冰糕’染色体形态Fig.3 Chromosome morphology of‘Lemon Sorbet’

图4 ‘柠檬冰糕’染色体核型Fig.4 Chromosome karyotype of‘Lemon Sorbet’

图5 ‘柠檬冰糕’染色体核型模式图Fig.5 Chromosome karyotype pattern of‘Lemon Sorbet’

2.3 倍性鉴定

6个朱顶红园艺品种的染色体制片结果表明：‘凤蝶’染色体计数为22条;‘特伦蒂诺’染色体计数为33条;‘粉色惊奇’‘快车’‘苹果花’‘樱桃妮芙’染色体计数均为44条(图6)。因朱顶红品种染色体基数为11,故‘凤蝶’染色体数目为2n=2x=22,具有两个染色体组,为二倍体朱顶红;‘特伦蒂诺’染色体数目为2n=3x=33,具有三个染色体组,为三倍体朱顶红;‘粉色惊奇’‘快车’‘苹果花’‘樱桃妮芙’染色体数目为2n=4x=44,具有四个染色体组,均为四倍体朱顶红。

图6 不同朱顶红品种的染色体形态Fig.6 The chromosome morphology of different Hippeastrum cultivars

3 讨论

染色体制片技术环节主要包括：取材时间与部位、预处理方法、固定时间、解离试剂与时间、低渗时间等[18]。其中预处理的主要作用是阻断纺锤体形成、提高中期分裂相频率、促进染色体缩短、改变胞质粘度等。目前常用的化学处理试剂为8-羟基喹啉、秋水仙素、饱和对二氯苯和α-溴萘,藜芦碱、风油精、放线菌酮等也有少量研究者使用[19]。物理处理方法主要是0—8℃低温处理[20]。朱顶红的核型分析中,邹琦丽等[12]并未提及研究中所用的预处理方法,陈瑞娇[13]采用的是秋水仙素预处理朱顶红根尖的方法。本研究首次使用了8-羟基喹啉与低温处理相结合的方法,其试剂毒性相对秋水仙素较小,获得的染色体形态分散良好、缩短长度适宜、缢痕明显,可以在朱顶红染色体制片研究中推广应用。解离的作用是促进细胞分散和染色体分离。酶解主要使用的试剂是纤维素酶与果胶酶,费用相对昂贵,温度在25—37℃,时间一般在1—4 h[6]。酸解一般使用的试剂为盐酸,费用低廉,温度为60℃,时间一般为5—20 min[7,20]。由此可知,酸解是一种比较高效低廉的解离手段,本研究和陈瑞娇[13]均采用了酸解的方法,效果非常理想,因而在朱顶红制片中应优先采用。

本研究认为朱顶红品种‘柠檬冰糕’的核型公式为K(2n)=3x=33=12 m+12 sm+9 st,其中1、2、3、4号染色体类型为sm,5、6、7号染色体类型为st,8、9、10、11号染色体类型为m。邹琦丽等[12]和陈瑞娇[13]分别对朱顶红原生种‘线缟华胄’和白肋朱顶红进行了核型分析,其核型公式分别为K(2n)=3x=33=12 m+9 sm+12 st和 K(2n)=2x=8 m+6 sm+8 st,其中 1、2、3 号染色体类型为 sm,4、5、6、7 号染色体类型为st,8、9、10、11号染色体类型为m。本研究和前人研究结果基本一致,唯一的分歧在于4号染色体类型。前人的研究中4号染色体臂比值为3.06—3.07,而本研究中4号染色体臂比值为2.85,比值相差并不大,因而这种差异很有可能是染色体测量误差导致。综合这3次核型分析结果来看,朱顶红核型不对称系数(As.K)分别为72.59%、69.96%、70.19%,核型类型均为3B型。在生物进化过程中,染色体核型不对称程度越高,其进化程度也越高[17],因此朱顶红应该是植物演化史中进化程度较高的物种。另外,这3个朱顶红品种染色体基数均为11,核型也基本一致,说明朱顶红属植物在亲缘关系上较为接近,这与朱顶红大部分原生种可以轻易杂交这一现象也比较一致。

本研究还对6个朱顶红品种‘凤蝶’‘特伦蒂诺’‘粉色惊奇’‘快车’‘苹果花’‘樱桃妮芙’进行了倍性鉴定。‘凤蝶’原产巴西,是1970发现的原生种;‘特伦蒂诺’为南非园艺品种,于2007年育成;‘粉色惊奇’‘快车’‘苹果花’‘樱桃妮芙’是荷兰育种家分别于2005年、2001年、1954年和2004年培育成的园艺品种。研究结果表明：‘凤蝶’为二倍体,‘特伦蒂诺’为三倍体,‘粉色惊奇’‘快车’‘苹果花’和‘樱桃妮芙’均为四倍体。花瓣形态数据表明,‘粉色惊奇’‘快车’‘苹果花’和‘樱桃妮芙’相比‘凤蝶’‘特伦蒂诺’花径更大(未发表),观赏性状更为优良。说明朱顶红多倍体育种在观赏性方面改进较大,具有较为重要的意义。另外,杂交育种在朱顶红育种工作中占有重要地位,在近年来国内外育种家的共同努力下,朱顶红园艺品种越来越多,而对这些来源不同的品种进行的系统性归纳和研究并不多。本研究对其中1个原生种和5个园艺品种在染色体水平上进行了倍性鉴定,为杂交育种和倍性育种工作的开展提供了细胞遗传学理论基础。