对健那绿跨膜运输问题的理论分析

何金华 周红霞 顾影影 李明凯* 王爱民 朱永元

（1 江苏省滨海中学 江苏滨海 224500 2 江苏师范大学生命科学学院 江苏徐州 221116 3 滨海县人民医院 江苏滨海 224500）

活性染色是指利用某些无毒或毒性较小的染色剂显示细胞内某些天然构造存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致细胞死亡的一种染色方法［1］。活性染色按染色途径和方法可分为体外活性染色和体内活性染色，用健那绿染色线粒体属于体外染色，以台盼蓝或者墨汁注入动物腹腔研究吞噬细胞则属于体内染色。

对细胞、 细胞器或其他物质染色的目的是为了对所染色对象进行结构和代谢方面的观察。在众多的染料中，高中生物学所涉及的活性染料有3 种，分别是健那绿、亚甲基蓝和台盼蓝，目前高中生物学教学中对健那绿染料的实验过程分析较深入，但对健那绿如何进入细胞染色出现较多的争议，现从活性染料健那绿的化学本质、 染色机理、运输方式及试剂配制4 个方面进行综合分析。

1 化学本质

1.1 化学结构 健那绿，别称詹纳斯绿、 铁苏木精，分子式C30H31ClN6，为具有吩嗪结构的碱性染料。吩嗪结构具有难溶于水、微溶于乙醇等有机物质，固态成针状晶体，颜色为近乎无色等特征。从结构式分析，健那绿中含有4 种基本基团，分别为二甲基胺 （氢原子被取代后认为含叔胺）、 二乙基胺（氢原子被取代后认为含叔胺）、 苯环和吩嗪结构（含仲胺、季胺）（图1）。从整体结构上看，由于该结构属于氯化物的盐类，因此可溶于水，但水解后产生的阳离子基团因携带3 种结构而呈现不同的溶解性质，所以该物质最终表现的化学性质为溶于水还是溶于有机溶剂时必须将其一分为二进行分析。

图1 3 种N 中心原子的化学结构

1.2 化学性质

1.2.1 吩嗪结构的化学性质 在化学上，吩嗪及其衍生物是重要的精细化工的原料，在人类的生产生活中具有广泛的应用［2］，例如目前很多菌种分泌的吩嗪结构物质可以作为有效的杀菌药物。

从吩嗪结构基团的极性角度看，吩嗪结构为典型的呈正六边形的非极性结构；从阳离子基团的极性角度看，由于健那绿左右两侧的结构基团不一致，其电荷中心不能重合，因此整个阳离子基团是极性结构。从化学“相似相容”的一般原理分析，极性分子应与极性分子互相溶解，非极性分子应与非极性分子溶解，可以知道，水解后的健那绿的阳离子基团可溶于水而微溶于有机溶剂。但在某些情况下，分子的溶解性并不仅仅取决于其极性及极性的大小，应更多地看其分子结构是否相似。

吩嗪结构为具有3 个环状结构的有机物，不具备羟基，其结构与水的结构完全不同，因此，虽然两者都有极性，但在溶解度上却是不相溶的，或者说吩嗪结构在水中的溶解度极低，即难溶于水。

1.2.2 有机胺结构的化学性质 有机胺种类多样、结构多种，具有较为极端的生理性质，如致癌等。健那绿阳离子基团中的有机胺分别为二甲基胺（1）、二乙基胺（2）、仲胺（3）、季胺（4）4 种，具体结构如图所示：

图2 4 种有机胺

在有机化学中，伯、仲、叔胺都能与水分子形成氢键，因此低级胺易溶于水，胺的溶解度随分子量的增加而迅速降低，从6 个碳原子的胺开始就难溶于水，而一般可溶于醇、苯等有机溶剂［3］。从健那绿的拆分结构看，除了季胺不易溶于水外，其余3 个有机胺均可溶于水；从整体分子结构看，其碳原子的总数远远多于6 个，不易溶于水。

1.2.3 甲基的化学性质 在药物化学中，甲基的应用非常广泛，可用于合成特殊性质的有机物。有研究表明，在药物分子中引进甲基，能够增加化合物的脂溶性，进而提高透过生物膜的能力［4］。在健那绿分子中，具有多个甲基基团，在一定程度上增加了其脂溶性。

综上所述，对健那绿分子的阳离子基团而言，其溶于水的能力较弱，而可以溶于有机溶剂。

2 染色机理

2.1 基本原理 健那绿是对线粒体具有专一性染色且毒性最少的一种碱性染料，其基本原理是由于线粒体中细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态而保持蓝绿色，而细胞质则被还原为无色。因此，健那绿不仅可以用于进行线粒体的观察，也可以用于区分活细胞与死细胞，例如细菌细胞膜上有氧化酶，所以细菌也可以被健那绿B 染成蓝绿色［5］。当然，虽然健那绿是活性染料，但是对染色时间也是有要求的。有研究表明，人口腔上皮细胞一般染色20 min 左右，时间稍长或稍短没有明显影响［6］，但时间过长（约1 h）后，细胞会死亡而影响实验的观察。

2.2 线粒体的染色原因 从前面的原理分析中得知，健那绿能够染色线粒体的主要原因在于线粒体膜具有氧化酶，能够使甲基绿保持氧化状态而呈现蓝绿色。但问题的关键在于为什么染料能够进入线粒体而不在于为什么呈现蓝绿色。

解决这个问题的关键在于要了解染料的电化学的特性。从上述分析中得知，健那绿水解后带有颜色的部分是阳离子基团而不是阴离子（Cl-），阳离子基团更容易和阴离子基团结合。

第1，线粒体膜具有氧化酶系。由于质子泵的存在，使得线粒体膜间隙聚集了大量的阳离子，即呈现正电荷，而线粒体基质则由于聚集了大量的阴离子，即呈现负电荷。因此，线粒体基质可以有效吸引呈现正电荷的健那绿阳离子基团。第2，有研究表明，线粒体外膜通透性较高，允许分子量在15 kD 以下的分子通过，而内部则不允许分子量大于1.5 kD 的分子通过［7］，因此，分子量为511Da的健那绿可以通过外膜和内膜进入线粒体基质。第3，在线粒体的内、外膜之间还存在着“孔蛋白”的离子通道或离子转运体［8］，也有可能对健那绿物质的运输具有辅助作用。综上所述，在阴、阳离子的相互吸引及可能的孔蛋白的帮助下，健那绿的阳离子基团可以进入线粒体被氧化而呈现蓝绿色。

3 健那绿进入细胞的运输方式

3.1 健那绿进入细胞的运输方式的问题 在染色过程中，健那绿可以进入细胞中的线粒体，使得线粒体着色成蓝绿色。有教师认为，健那绿进入细胞中的运输方式为胞吞或者主动运输，原因在于实验过程中需要用到生理盐水，所以其可溶于水，因而是亲水性而非脂溶性的物质；也有教师认为，健那绿进入细胞的运输方式为自由扩散，原因在于其结构中具有吩嗪结构，因此是脂溶性的，可以通过自由扩散进入细胞中。

3.2 健那绿进入细胞的运输方式的分析 上述2 种观点的争论在于没有了解健那绿的化学结构及其性质导致的。从前面关于健那绿的结构和形式的描述中得知，在溶于水的主要原因在于健那绿是氯化物的盐类，其水解后的阳离子基团很难溶于水。

在了解上述问题的基础上，对甲基绿进入细胞的方式进行分析。从生理学角度讲，甲基绿相较于细胞来说是外界物质，且其具有一定的毒性（活性染料一般是经稀释后低毒或无毒，并不是本身就低毒或无毒），因此细胞不能主动吸收该物质，即不会通过胞吞或主动运输吸收； 从化学结构和性质角度讲，甲基绿水解后的阳离子具有脂溶性，可以扩散通过细胞膜。因此，阳离子进入细胞中的方式是自由扩散。

所以，进入细胞中的结构应该是健那绿水解后的阳离子基团而非健那绿的整个结构，且阳离子脂溶性使得可以通过扩散的方式进入细胞。

3.3 “箭头模型”假说 “箭头模型”假说形象化了健那绿的分子结构，更为直观的阐述其通过膜的方式。该模型中，以吩嗪结构作为“箭头”，以“二甲基胺和二乙基胺”作为“两翼”，共同构成完整的“箭头模型”，具体模型如图3所示。

图3 健那绿运输的“箭头模型”

吩嗪结构的脂溶性下，阳离子自由扩散通过膜结构，其两翼的二甲基胺和二乙基胺逐次依次通过，剩下的苯环结构最终通过膜。

4 配制健那绿溶液时的问题

1）为什么要加入生理盐水而不是蒸馏水或纯净水。

生理盐水，即与人体内环境浓度基本相当的无菌盐水，其基本作用在于维持细胞渗透压，防止发生吸水涨破。在实验中，一般所使用的材料为人口腔上皮细胞的线粒体，因此用生理盐水有助于保持细胞的活性。一般而言，在实验操作中的线粒体的活性保持时间约为1 h。

如果在实验操作时加入蒸馏水或纯净水，虽然后续制片过程中也有生理盐水，但因在添加染料时会重复多次操作，很明显，这样操作会降低生理盐水的浓度，有可能使细胞吸水涨破，所以不能加入蒸馏水或纯净水。

2）为什么不将健那绿溶解到有机溶剂再进行染色。

第1，由于大多数的有机溶剂是有毒的，对细胞具有毒害作用，容易通过自由扩散进入细胞内导致毒害的发生，而且即使没有毒害的发生，也会和脂溶性的健那绿发生类似于群落中的“种间竞争”关系而导致染色效果不好，因此实验时要尽可能不用有机溶剂。

第2，在健那绿的单质中，需要的是经过解离后的阳离子基团，而非整个健那绿单质，因为如果是健那绿的单质，则不能通过阴阳离子的结合附着在线粒体膜上（前面已经叙述），因此，需要用水进行解离获得阳离子基团。

3）为什么要加热。健那绿要溶解在生理盐水中使用，而实际操作中，它的溶解度并不大，溶解速度也非常缓慢，所以要对溶液加热使得健那绿燃料能够快速、充分地溶解在生理盐水中。温度超过50℃，健那绿就可能发生水解导致不能染色，所以推荐加热温度30～40℃。这同时也是大多数生物的体温。使用30～40℃的染料对活细胞进行染色，也有助于提高细胞代谢水平，加快染色进度。加热的步骤事实上也验证了前面所说的健那绿的水解与脂溶性的问题。

5 其他问题

在药代动力学中，还有分子极性表面积与药物吸收之间的关系。通过分析有机分子的极性表面积可以预测该物质能否通过细胞膜及通过细胞膜与物质浓度之间的线性或者非线性的关系，也不失为探讨本文问题的方法之一。