水稻突变体文库及全长cDNA文库综述

刘鑫

摘 要：主要对大型突变体文库、全长cDNA文库两方面进行介绍，并举例说明对作物遗传改良有影响的一些进展。

关键词：水稻；突变体文库；全长cDNA文库

1 突变体文库

通过敲除、抑制、过表达和异位表达，从而改变基因的表达水平或模式，这是破译基因功能的常用策略之一。因此，构建饱和突变体文库对于基因功能的鉴定是必不可少的。目前，不同国家的许多实验室已经利用多种策略（包括T-DNA、转座子和逆转录转座子插入）开发了突变体文库，其材料和相关数据正在迅速积累当中。

除了敲除或抑制基因的表达外，这种文库还可用于揭示标记基因的表达模式。T-DNA和转座子可通过添加功能元件，如激活标签、基因捕获标签、启动子捕获标签和增强子捕获标签等进行修饰。例如，Wu等人[1]采用了3种水稻基因组功能分析策略构建了突变体文库，其中包括插入诱变、增强子诱捕和异位表达。插入诱变是突变体文库的共同特征。许多增强子捕获系统已经使用了GAL4-VP16元件，当T-DNA插入增强子附近时，GAL4-VP16将被表达，并且GAL4-VP16将与UAS结合，促使报道基因GUS或GFP的转录。对于异位表达，需要产生目标系，且靶基因将由UAS启动子驱动表达。当模式系与效应系杂交时，GAL4-VP16可以与UAS结合，从而指导目的基因的表达。结果表明，该系统在异位表达检测基因功能方面效果很好。因此，除了插入引起功能缺失突变以外，增强子诱变突变体文库还可以提供一系列组织特异性表达株系，用于多种目的[2]。

研究者们[3]投入了大量的工作来分离插入位点的侧翼序列，以提供插入标签（侧翼序列标签，FST）。使用的手段包括热不对称交错（TAIL）-PCR、反向PCR和衔接头PCR。尽管T-DNA转化株系总数很大，然而由于FST序列分离速度缓慢，侧翼序列数据库的完善仍有很长的路要走。

合成、管理、维护和筛选如此庞大的文库，其复杂程度是十分巨大的。此外，T-DNA的非随机分布发生在不同层次的基因组结构上，偏向于大片段染色体而在TE相关序列插入频率低，优先发生在基因的5'-上游和3'-下游区域，且差异出现在某些类别的功能基因中。这种分布模式导致T-DNA插入途径在获取某些基因组区域和恢复某些类型的基因方面有较大的困难。因此，更有效的替代方法有待继续探索。

除T-DNA插入之外，化学和物理诱变也可以为构建饱和突变体文库提供途径。如今新的测序技术提高了识别突变位点的能力，使其可行性大大提升。RNA干扰技术是另外一个方法，该方法通过人造miRNAs沉默靶基因从而产生缺失突变体，它们多具有组织特异性或可诱导性[4]。这种方法的一个好处是仅仅需要很少的突变株就能获得基因组的饱和突变。

2 全长cDNA文库

通过全长cDNA文库提供的信息，可以鉴定转录单位、内含子、外显子、可能的启动子以及预测的基因产物，从而极大地帮助基因组序列的注释。此外，全长cDNA文库可以提供经常用于基因分离的基因克隆的目录，从而节省相当大的工作量，促进基因组学和蛋白质组学的研究。

研究工作者们在收集全长cDNA克隆工作中已经取得两个大的进展。在粳稻的研究方面，Kikuchi等人[5]通过从粳稻品种日本晴文库中收集全长cDNA克隆起始了这项工作。目前，已经分离出的全长cDNA克隆序列可以通过检索水稻分子生物學百科全书数据库获得。在籼稻工作中，研究人员已经从籼稻品种广陆矮4号和明恢63号中分离出20 000多个全长cDNA克隆，科研人员可以通过搜索籼稻cDNA数据库获取这些克隆。另外，这些籼稻、粳稻和野生稻的全长cDNA克隆也为比较基因组学的发展提供了重要资源。

参考文献：

[ 1 ] Wu C，Li X，Yuan W，et al. Development of enhancer trap lines

for functional analysis of the rice genome[J]. The Plant Journal，

2003，35（03）： 418-427.

[ 2 ] Liang D，Wu C，Li C，et al. Establishment of a patterned GAL4-VP16

transactivation system for discovering gene function in rice[J].

The Plant Journal，2006，46（06）：1 059-1 072.

[ 3 ] Zhang J，Guo D，Chang Y，et al. Non-random distribution of T-

DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed

by analyzing 13 804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-

trap mutant library[J]. The Plant Journal，2007，49（05）：947-959.

[ 4 ] 肖景华，吴昌银，张启发. 水稻功能基因组研究进展与发展展

望[J]. 中国农业科技导报，2013，15（02）：1-7.

[ 5 ] Kikuchi S，Satoh K，Nagata T，et al. Col-

ection， mapping，and annotation of over

28 000 cDNA clones from japonica rice[J].

Science，2003，301（5631）： 376-379.

（收稿日期：2018-07-17）