葛根芩连汤配方颗粒和传统汤剂的HPLC的指纹图谱对比研究

李红　李妍　田杰　王艳　张颖

摘要 目的：采用高效液相（HPLC）比较研究葛根芩连汤配方颗粒剂和传统汤剂的指纹图谱差异。方法：首先选择3家不同医院A、B、C的葛根芩连汤配方颗粒剂和传统汤剂，配制对照品溶液和供试品溶液后，以优化的色谱条件进行HPLC指纹图谱研究。结果：HPLC中间精密度试验、重复性试验和稳定性试验均显示良好。葛根芩连汤颗粒剂HPLC指纹图谱发现前5 min K1、K2和K3的谱图差异较大，5 min后3家不同医院葛根芩连汤颗粒剂HPLC指纹图谱有10个相似的特征峰，其中K3特征峰的成分含量与K1和K2存在较大差异，尤其是1号峰和4号峰。K1和T1、K2和T2、K3和T3颗粒剂和传统汤剂的比较中，颗粒剂特征峰的含量较传统汤剂高。结论：葛根芩连汤配方不同医院颗粒剂和传统汤剂的HPLC指纹图谱存在一定差异。

关键词 高效液相；指纹图谱；葛根芩连汤；精密度；重复性；加样回收；稳定性；专属性

Abstract Objective：To compare the fingerprints of Gegen Qinlian Formula granules and its traditional decoction by high performance liquid phase （HPLC）.Methods：Gegen Qinlian Decoction Formula granules and traditional decoctions from 3 different hospitals A，B，C，were selected.After preparing the control solution and test solution，the HPLC fingerprint analysis was carried out under the optimized chromatographic conditions.Results：The results of HPLC intermediate precision test，repeatability test and stability test were all good.Gegen Qinlian Decoction granules HPLC fingerprint showed that the spectra of K1，K2 and K3 differed greatly during the first 5 min.Then after the 5 min，HPLC fingerprint of Gegen Qinlian Decoction Formula granules from 3 different hospitals had 10 similar characteristic peaks，the content of K3 characteristic peak was quite different from K1 and K2，especially No.1 and No.4 peaks.In comparison of K1 and T1，K2 and T2，K3 and T3 of granules and traditional decoctions，the content of the characteristic peak of granules was higher than that of traditional decoctions.Conclusion：There are certain differences in the HPLC fingerprints of Gegen Qinlian Decoction granules and traditional decoction from different hospitals.

Key Words High performance liquid phase； Fingerprint； Gegen Qinlian Decoction； Precision； Repeatability； Sample recovery； Stability； Specificity

中圖分类号：R283.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.051

葛根芩连汤是由葛根、黄芩、黄连和甘草组成的经典方，该方出自中医经典《伤寒论》，属于表里双解剂，即可清解卫表，又可清里泻热，适用于伤寒表证未解，邪入阳明而致的邪热下利证，即现代医学的腹泻、痢疾等[1-2]。全方以葛根为君，辛甘凉入脾胃经，对因表证未解，里热已炽而引起的身热口渴、胸闷口干等症状行解表退热之功，对因热邪内迫，大肠传导失司致下利臭秽和肛门灼热等症状行升阳止利之效；黄芩、黄连助君药解表清里，燥湿止利，其中黄芩“主治诸经实热……泻肺火，清痰利气”，对肺之里热上蒸致咳致喘，具有解肌汗出而解之功；甘草调和诸药而为佐使。传统的中药汤剂具有不方便携带，熬药时间较长等不足，而生活节奏较快又想服用中药的患者则感到不便。近年来出现的中药配方颗粒剂，以其配方的全成分提取而制成，使患者服用中药更加省时便捷，携带方便[3-5]。对于配方颗粒剂与传统汤剂中指纹图谱是否存在差异，目前研究较少。本研究基于葛根芩连汤，采用HPLC指纹图谱比较的方法研究其配方颗粒和传统汤剂的差异，报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 购于安捷伦科技（中国）有限公司的高效液相色谱仪（型号Agilent-1100）、四元泵（型号G1321）和二极管阵列检测器（型号G1315DAD）等；购于青岛君道生物技术有限公司的Ultimate AQ C18柱。

1.2 试剂 购于上海展云化工有限公司色谱HPLC乙腈和色谱HPLC甲醇；中国食品药品检定研究院提供的超纯水和葛根素对照品（110752-200410）。

1.3 分析样品 随机选取A、B、C 3家不同医院的葛根芩连汤颗粒剂和汤剂进行比较研究，其中A医院葛根芩连汤配方颗粒剂K1为神威药业集团有限公司，葛根17050211，每袋1.5 g相当于饮片15 g；黄芩17062171，每袋0.9 g相当于饮片10 g；炙甘草17062321，每袋0.6 g相当于饮片3 g；黄连17052811，每袋0.5相当于饮片3 g；B医院颗粒剂K2为广东一方制药有限公司，葛根7095323，每袋200 g相当于饮片2 000 g；黄芩7105893，每袋200 g相当于饮片1 120 g；炙甘草7120593，每袋200 g相当于饮片1 000 g；黄连7092273，每袋200 g相当于饮片1 200 g；C医院颗粒剂K3为东营诺康生物技术有限公司，葛根990207，每袋200 g相当于饮片2 000 g；黄芩981104，每袋100 g相当于饮片510 g；炙甘草990209，每袋100 g相当于饮片500 g；黄连990210，每袋100 g相当于饮片600 g。配方顆粒剂药物组成均相当于中药饮片葛根30 g，黄芩20 g，炙甘草6 g，黄连6 g，这3家医院对应的中药饮片厂家各不同。见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用4.6 mm×250 mm的C18保护柱（5 μm），以室内温度为柱温，进样量为20 μL以乙腈为流动相A，甲醇为流动相B，流速1.0 mL/min：检测波长为280 nm。

2.2 对照品溶液的制备 首先将葛根素对照品放置于60 ℃真空干燥至恒重，然后分别精密称取10.3、5.3 mg于50 mL量瓶中，加入50%甲醇适量并超声溶解，混合均匀后制成葛根素对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 根据葛根芩连汤的配伍比例，即葛根15 g、黄连9 g、甘草6 g、黄芩9 g。根据3家不同医院提供的药材，采用传统汤剂煎煮方法，先煮葛根后入诸药得200 mL浓缩混合药液，采用0.45 μm微孔滤膜过滤混合药液制成供试品溶液。葛根芩连汤同配比对应颗粒剂以水溶解，直至完全无可见沉淀物即为颗粒剂供试品溶液。

2.4 专属性试验 取同一供试品溶液根据2.3制备的供试品溶液，采用HPLC色谱法对葛根芩连汤进行专属性试验，结果显示葛根芩连汤专属性良好。

2.5 线性关系考察 精密量取葛根素对照品的甲醇溶液3.0、6.0、12.0、18.0、24.0 mL，分别置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀后分别精密吸取10 μL，采用HPLC色谱法，记录峰面积；以对照品进样量（μg）为横坐标（X，峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，葛根素回归方程y=2.269 3X+29 028，r=0.999 1（n=5），结果表明，葛根素对照品在5.03～504.06 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6 中间精密度试验 精密取同一2.3制备的供试品溶液，在一组相同的测量程序、相同地点等测量条件下，对被测对象在一长时间段内重复测量进行中间精密度试验，本研究重复测量5次，大于总峰面积5%的色谱峰相对峰面积精密度结果最终取平均值，研究结果显示葛根芩连汤供试品溶液中间精密度良好。见表2。

2.7 供试品溶液稳定性试验 由于固定相的稳定性都是有限的，因此的HPLC试验开始前，需要确定供试品溶液的稳定性，以保障后续研究结果的误差最小，可靠性最高。本研究采用同一供试品溶液重复进行5次试验，研究结果显示葛根芩连汤供试品溶液稳定性良好，平均RSD为1.8%。见表3。

2.8 重复性试验 采用同一供试品溶液，连续进样5次进行短时间内的连续重复性测试，以保证HPLC方法学的可重复性，本研究结果显示葛根芩连汤的重复性良好，平均RSD为1.9%。见表4。

2.9 回收率试验 精密称取5份已知含量的同一批葛根芩连汤样品各约0.5 g，分别精密加入20 mL混合对照品甲醇溶液，采用加样回收法测定，计算结果显示平均回收率为99.09%，RSD为0.78%。

2.10 样品测定结果 由图1、图2和图3中葛根芩连汤颗粒剂HPLC指纹图谱发现前5 min K1、K2和K3的谱图差异较大，然后5 min后3个不同医院葛根芩连汤颗粒剂HPLC指纹图谱有10个相似的特征峰，其中K3特征峰的成分含量与K1和K2存在较大差异，尤其是1号峰和4号峰。K1和T1、K2和T2、K3和T3颗粒剂和传统汤剂的比较中，颗粒剂特征峰的含量较传统汤剂高。

3 讨论

随着现代科学技术对中药复方研究的不断深入发掘，中药复方的制剂工艺和制剂质量等都有所提高，因此不断致力于将中药推向现代化具有重要的意义。20世纪末对中药复方研究制备方法分为分煎和合煎[6]，本研究中葛根芩连汤配方颗粒剂属于分煎的范畴[7-8]，而传统汤剂属于合煎的范畴[9]。而中药复方无论是药物分煎后混合和传统汤剂合煎，与单味药物比较，其化学成分含量均会产生变化，研究者就半夏和生姜，单味药物分煎与合煎进行比较，HPLC指纹图谱结果显示，合煎后存在色谱峰含量变化[10]。本研究结果显示，颗粒剂指纹图谱K3与K1、K2存在一定差异，T1、T2和T3指纹图谱未见明显差异，可能与不同医院对应的药材及相应的制作设备、工艺流程等存在差异有关[11]。有研究[12]以指纹图谱层方式研究补肾方配方颗粒剂和传统汤剂，通过HPLC的研究方法考察最佳的检查波长，并结合不同品牌的C18色谱柱不断的优化其HPLC的色谱条件后，研究结果显示补肾方配方颗粒剂和传统汤剂提取物中指纹图谱存在差异，其中配方颗粒剂的主要化学成分提取率大于传统汤剂。本研究结果显示，K1和T1、K2和T2、K3和T3颗粒剂和传统汤剂的比较，颗粒剂特征峰的含量较传统汤剂高，提示葛根芩连汤配方颗粒剂和传统汤剂的指纹图谱存在差异，而这种差异可能是由于复方合煎与分煎时化学成分的差异而导致的。如果葛根芩连汤配方颗粒剂和传统汤剂在化学成分上存在差异[13-14]，则两者间在药效上也必然存在差异。近年来，中药复方的配方颗粒剂与传统汤剂在药效学上的差异受到了广泛关注，而在研究配方颗粒剂与传统汤剂的问题时，应该结合药效学从复方整体分析评价配方颗粒剂与传统汤剂的优劣[15-18]；具体差异的化学成分和药效比较，本研究并未展开，后续可配合质谱、红外光谱等进行深入研究。

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（2018-05-07收稿 责任编辑：张雄杰）