秃房茶嘌呤生物碱组成特点及生化品质成分的研究

滕杰 曾贞 黄亚辉

摘 要：該研究采用分光光度法和高效液相色谱法，分不同叶位对秃房茶（Camellia gymnogyna）的嘌呤生物碱组成特点以及茶多酚、儿茶素组分、游离氨基酸、黄酮、茶氨酸等生化品质成分进行了测定。结果表明：秃房茶的嘌呤生物碱组成及配比显著区别于茶叶植物凤凰单从（C. sinensis），同时具有可可碱、咖啡碱和苦茶碱三种组分，而且可可碱含量最多，为13.46～39.72 mg·g-1，咖啡碱含量最低，为0.51～2.02 mg·g-1，苦茶碱含量介于两者中间并随芽叶成熟度增加而升高。茶叶植物只存在咖啡碱和可可碱，含量变化分别为22.22～53.13 mg·g-1和0.47～12.82 mg·g-1。在相同叶位中，秃房茶儿茶素组分含量变化规律为EGCG>C>ECG>EGC>EC>GC>CG>GCG，且儿茶素总量、酯型儿茶素含量均低于茶叶植物，而非酯型儿茶素总量接近，保持为40～50 mg·g-1。除黄酮含量在各叶位变化趋势不大外，其他品质成分含量变化基本符合第1叶>芽>第2叶>第3叶>第4叶，一芽二叶的含量介于第1叶和第2叶之间的规律，而茶多酚、黄酮、茶氨酸等其它品质成分含量均低于茶叶植物。该研究首次明确了秃房茶主要生化品质成分变化规律，特别是嘌呤生物碱的组成及配比特点，且含有特征性成分—苦茶碱。该研究结果为生物碱代谢机理、特异茶加工、功能成分开发、低咖啡碱资源、选育种等提供了优良材料。

关键词：秃房茶，苦茶碱，HPLC，生物碱，儿茶素

中图分类号：Q946.88，S571.1

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）05-0568-09

Abstract：In order to investigate components of purine alkaloids and contents of tea polyphenols，catechins，free amino acids，flavonoids and theanine （Thea） in different leaf positions of Camellia gymnogyna were studied by the methods of ultraviolet spectrophotometry and high performance liquid chromatography （HPLC）. The results showed that the component of purine alkaloids，consisted of caffeine （Caf），theobromine （Tb） and theacrine （Tc），had significant differences between the C. sinensis and C. gymnogyna. Tb content was the highest，reached 13.46-39.72 mg·g-1，Caf content was the lowest，only kept 0.51-2.02 mg·g-1，and the content of Tc increased with leaves maturing. However， C. sinensis only contained caffeine and theobromine，whose contents respectively varied from 22.22 to 53.13 mg·g-1，0.47 to 12.82 mg·g-1. In the same tea leaf position，catechins component of C. gymnogyna were as follows：EGCG>C>ECG>EGC>EC>GC>CG>GCG，and the total amount of catechins，ester-catechins were significantly lower than C. sinensis，while none-ester catechins content was almost the same，kept 40-50 mg·g-1. The content of flavonoids demonstrated almost same in different leaf positions while other biochemical components content were as follows：the 1st leaf > bud > the 2nd leaf > the 3rd leaf > the 4th leaf，and the contents of one bud and two leaves were between the 1st leaf and the 2nd leaf content； while tea polyphenols，flavonoids，theanine and other quality components were lower than those of C. sinensis. This study clarified the changes of the main biochemical quality components of the C. gymnogyna for the first time，especially the composition and proportion of purine alkaloids，which contained the characteristic ingredient-theacrine. The research could be served as important and valuable tea tree resources，and application in alkaloid metabolism mechanism，special tea processing，functional ingredients，low caffeine resources and genetic breeding.

Key words：Camellia gymnogyna，theacrine，HPLC，alkaloid，catechin

茶树鲜叶中主要生化成分的含量和比例是鉴别茶树种质资源、茶树选育种、决定茶类适制性和茶叶综合利用价值的物质基础，在大量茶树资源中不乏优质和特异资源，可直接用于茶叶加工或资源创新 （段学艺等，2012）。茶含有多种功能性物质，是健康之饮集中体现 （Hayat et al，2015；Ryu et al，2017），最常见的茶多酚是一类存在于茶叶中的多元酚混合物，主要由儿茶素、花青素与花白素类、酚酸及缩酚酸类、黄酮及黄烷醇类组成，占干茶重的18%～36% （Xiao et al，2007），它与茶叶品质及适制性密切相关，是绿茶滋味浓度和苦涩味的代表物质，是红茶色、香、味等品质的关键因素，是茶品浓度的物质基础（刁春英和高秀瑞，2016）。氨基酸是呈现茶叶鲜爽味的主要物质，不仅与茶叶香气的形成有关，还影响茶汤的滋味和色泽 （曲映红和王建中，2016）。酚氨比值大小可以作为茶树鲜叶适制性的另一指标（杨兴荣等，2016）。茶氨酸作为茶叶的特征性氨基酸，属于谷氨酰胺类化合物，占茶叶干重的 1%～2%，具有调节免疫、增强记忆、安神镇静等多种生物活性，被誉为“天然镇静剂”（Tai et al，2015；郭晨等，2017）。嘌呤生物碱作为茶树的主要次生代谢产物之一，主要包括咖啡碱、可可碱、茶叶碱、苦茶碱（属于甲基尿酸）等 （金基强等，2014）。生物碱是茶叶风味的主要生化物质之一，同时也是重要的功能成分。由于氧化及甲基化等生物代谢作用影响，不同种类的嘌呤取决于嘌呤环上的甲基位置和个数的不同（Ashihara et al，2008）。

植物形态表型性状是种质资源的重要特征，生化成分和抗性性状是种质资源的物质基础 （乔小燕等，2015），而茶树种质资源是品种创新、茶叶品质提升和开发新产品的物质保障。结合国内外茶组植物分类研究，通常将茶组植物分为大厂茶 （Camellia tachangensis）、秃房茶 （C. gymnogyna）、厚轴茶 （C. crassicolumna）、大理茶 （C. taliensis）和茶 （C. sinensis）等5种，此外，在茶下又分茶 （C. sinensis var. sinensis）、普洱茶 （C. sinensis var. assamica、白毛茶 （C. sinensis var. pubilimba） 等 3 变种的分类系统。野生茶树主要属于大厂茶、秃房茶、厚轴茶、大理茶，个别属于茶，栽培型茶树主要属于茶种及普洱茶、 白毛茶等变种（陈亮，1996；陈玲，2000；陈亮等，2000；龚万灼和张泽岑，2006）。

金秀瑶族自治县位于广西壮族自治区中部偏东的大瑶山主体山脉上，整个山体呈东北向西南走向，总面积2 518 km2，山脊平均海拔1 200 m。我们研究团队自2012年开始就对金秀县境内野生茶资源、种类、生物性状、遗传进化和品质成分进行系统研究，在调查过程中发现除茶种以外，还有厚轴茶、秃房茶等群体（黄亚辉等，2014，2015）。该文以广西金秀县大瑶山发现的秃房茶为实验材料，采用液相色谱法、紫外分光光度法测定其生物碱组成特点和生化品质成分含量变化。同时，将秃房茶的检测结果与茶叶植物[英红九号（C. assamica）、凤凰单从（C. sinensis）]部分品质成分进行对比，以期了解和掌握秃房茶资源的嘌呤生物碱组分特异性和生化品质含量，为秃房茶种质资源的保存、利用与创新提供科学依据，为特异资源的发掘和茶树新品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

DHG-101烘箱（江苏吴江市新意阳烘箱制造厂）；高效液相色谱（美国Agilent 1200）；UV-2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；AB204-N型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；DK-8D电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；SHZ-D （Ⅲ） 循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 材料

秃房茶鲜叶采摘于广西金秀瑶族自治县，英红九号和凤凰单从鲜叶采摘于华南农业大学校内茶树资源圃，采摘时间均为2016年7月。

1.3 主要试剂

儿茶素单体（EC、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG）、嘌呤生物碱单体（可可碱、茶叶碱、咖啡碱）标准品、茶氨酸标准品购于Sigma公司 （St. Louis，Missouri，USA），苦茶碱标准品购自上海佰特因医药科技有限公司，水为超纯水（>18.2 MΩ），乙腈、甲醇（色谱纯）购于国药集团化学试剂有限公司。福林酚试剂、Na2CO3、三氟乙酸、茚三酮、氯化亚锡、三氯化铝、磷酸缓冲液等均为市售国产分析纯。

1.4 生化品质成分测定方法

干茶样品制备方法为鲜叶采集后液氮速冻至实验室，微波固样后冷冻干燥。水分测定按 GB /T8304-2002 恒重法进行；茶多酚含量测定按GB / T8313-2008福林酚法进行；游离氨基酸总量按GB / T8305-2002茚三酮法测定；黄酮类化合物总量按GB / T8307-2002三氯化铝比色法测定。

生物碱、茶氨酸及儿茶素组分测定均采用高效液相色谱法（HPLC）测定 （Wang et al，2014），色谱柱为安捷伦Agilent Technologies C18 （4. 6 mm×250 mm，5 μm）。嘌呤生物碱检测条件：流动相A 为超纯水，流动相B为纯甲醇；恒定梯度洗脱，即0～50 min，流动相B保持为10%；柱温25 ℃；流速1.0 mL·min-1；检测波长232 nm；进样量10 μL。四个嘌呤生物碱标准品HPLC色谱图如图1：A所示。

茶氨酸检测条件：流动相A为0. 5 ‰ 三氟乙酸水溶液，流动相B為乙腈；梯度洗脱，5%～33% 流动相B 0～14 min；33%～5% 流动相B 14～20 min；柱温为25 ℃；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为199 nm；进样量为5 μL。标准品HPLC色谱图如图1：B所示。

儿茶素检测条件：流动相A 为0. 5 ‰ 三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱，8%流动相B 0～8 min；8%～13%流动相B 8～20 min；13%～20%流动相B 20～25 min；20%～25%流动相B 25～30 min；25%～30%流动相B 30～35 min；30%～35%流动相B 35～40 min；35%流动相B 40～45 min；35%～8%流动相B 45～50 min；柱温为38 ℃；流速为0.8 mL·min-1；检测波长为278 nm；进样量为10 μL。八个儿茶素组分标准品HPLC色谱图如图1：C所示。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2007，SPSS 19.0软件进行处理、统计分析，结果用x±s表示，液相色谱图采用 Agilent 1200 数据处理软件分析。

2 结果与分析

2.1 生物碱单体组成与含量分析

一般茶种植物中，咖啡碱占干重的2%～4%，可可碱约0.05%，茶叶碱约0.002%，苦茶碱主要分布在苦茶的幼嫩芽叶部分，0.3%～3% （周晨阳等，2011）。生物碱具有多种生理功效，但各组分间具有明显差异。咖啡碱是茶叶滋味鲜爽的主要组成物质，适量的咖啡碱摄入对人体健康有益，但高剂量摄入会刺激中枢神经，影响睡眠或引起兴奋过度等负面作用（吴世玲，2013）。因此，保持茶叶原有风味和其他功能成分的低咖啡碱茶及茶制品一直在研究。此外，苦茶碱可以改善动物单胺类神经递质含量的紊乱和保护神经元，具有较强的抗抑郁作用和改善记忆效果（Li et al，2015；谢果，2010）。

由表1可知，秃房茶同时含有可可碱、咖啡碱和苦茶碱，可可碱含量最多，其变化范围是14.37～39.72 mg·g-1，其次是苦茶碱，含量变化为5.82～9.10 mg·g-1，咖啡碱含量最低，含量变化维持为0.51～2.02 mg·g-1。以一芽二叶为例，可可碱的含量是苦茶碱的5倍，是咖啡碱的16倍。相同叶位比较发现，可可堿和咖啡碱随着芽叶成熟度而逐渐降低，都以第1叶部位的含量最高，但苦茶碱在各叶位中变化平稳，略有上升趋势。与英红九号和凤凰单丛茶叶植物相比（图2），秃房茶在生物碱的组成和含量配比上明显区别与茶叶植物，独含有苦茶碱组分，且可可碱含量最高，咖啡碱含量最低，保持在2.02 mg·g-1以下。此外，所有茶叶样品中都没有发现茶叶碱。

2.2 主要生化品质成分分析

秃房茶的茶多酚、氨基酸、黄酮、茶氨酸和酚氨比结果如表 2所示，秃房茶与英红九号茶叶植物的主要生化成分组成上相同，茶多酚在不同叶位的含量范围是185.05～393.81 mg·g-1，氨基酸总量的变化范围是13.74～23.74 mg·g-1，黄酮的变化范围是15.66～18.38 mg·g-1，茶氨酸的变化范围是13.81～24.42 mg·g-1，酚氨比值的变化范围是12.37～19.77。茶多酚、游离氨基酸随着叶位的增加逐渐下降，但是第3叶的茶多酚含量低于第2叶和第4叶含量，芽的茶多酚含量低于第1叶。黄酮含量在不同叶位分布含量变化不大，除芽含量是15.66 mg·g-1最低外，其他叶位均保持在18.0 mg·g-1左右。茶氨酸在芽和第3叶含量很高，分别达到21.92、24.42 mg·g-1，在其他叶位保持在14.0 mg·g-1左右。

2.3 儿茶素单体组成与含量分析

茶叶中的儿茶素是茶多酚的主体成分，占茶叶干重的12%～24%，占茶多酚总量的60%～80% （谢志英等，2014），它的组成和配比的差异是揭露茶树资源进化类型的一个重要指标，是决定茶叶品质及其健康功效的重要组分。儿茶素可分为酯型和非酯型儿茶素（又称“简单儿茶素”），其中非酯型儿茶素主要包括儿茶素（C）、没食子儿茶素（GC）、表儿茶素（EC）和表没食子儿茶素（EGC）；酯型儿茶素主要包括表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、儿茶素没食子酸酯（CG）和没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）（黄亚辉等，2015），具有抗氧化、抗诱变、抗癌、抗菌消炎、预防心血管疾病、防辐射和减肥等作用（Hayat et al，2015；Uchiyama et al，2011；柳敏等，2016）。

从表3可以看出，秃房茶在儿茶素组分上种类与茶叶植物一样，但含量配比上明显差异，相同叶位中，EGCG含量最高，其次是C、ECG、EGC、EC、GC、CG，而GCG含量最低。同一儿茶素组分，基本规律符合第1叶>芽>第2叶>第3叶>第4叶，而一芽二叶的含量一般介于第1叶和第2叶之间。与茶叶植物（英红九号）相比（图3，以芽、一芽二叶为对照），儿茶素总量以秃房茶偏低，单一儿茶素组分除C外，其他组分都要比茶叶植物低，但是秃房茶的简单儿茶素含量与茶叶植物相差不明显，茶叶植物的酯型儿茶素总量明显高于秃房茶。

3 讨论与结论

茶树作为多年生叶用经济作物，芽叶中的生化成分是决定茶叶品质的物质基础，在茶树品种选育的初期，常通过检测生化成分含量水平来判断茶叶品质和适制性，从而达到茶树资源早期筛选、鉴别、评价的目的。秃房茶作为一类比较特殊的茶资源，在茶植物分类研究中占有重要地位。结合笔者在前期植物学分类、鉴定基础上，本研究首次对秃房茶植株开展生化品质分析，发现秃房茶含有特征性成分—苦茶碱，而酯型儿茶素、总儿茶素、咖啡碱等含量均低于茶种，可可碱含量和酚氨比值在秃房茶中偏高。秃房茶生物碱组分及配比、儿茶素组分含量特别是酯型儿茶素含量的显著差异，其可能的原因在于资源分类、遗传本质的不同，从而导致生物碱代谢模式，儿茶素代谢水平的差异，需进一步围绕其植物形态学、遗传进化关系等方面系统阐述秃房茶的进化地位。

目前，对于同类型的生物碱茶资源研究比较透彻的是由张宏达在中国广东境内发现的一种天然无咖啡碱的茶树资源—毛叶茶（张宏达等，1988；吴春兰等，2014），该茶树生物碱组成由可可碱代替咖啡碱，不含或微含咖啡碱，亦称之为可可茶，在遗传进化、茶叶加工、可可碱代谢机理等方面研究颇多（Ashihara et al，1998；Jin et al，2016；Wu et al，2014；文海涛等，2008）。本研究结果发现，秃房茶在生物碱组分含量上类似于可可茶，更为宝贵的是同时存在苦茶碱。从代谢途径上分析，可可碱在咖啡碱合成酶作用下形成咖啡碱，咖啡碱经过氧化、异构化反应可以形成苦茶碱（晏嫦妤等，2014），但是，茶树中同时存在可可碱、咖啡碱、苦茶碱，且可可碱的含量最高的情况十分罕见，由此采取遗传学、分子生物学等技术手段研究其代谢途径机制提供原材料。

儿茶素作为茶多酚的主体成分，占茶叶干重的12%～24%，茶多酚总量的60%～80% （谢志英等，2014），其在鲜叶中含量与茶类适制性、茶叶品质、特定功能成分开发等密切相关。本研究中秃房茶资源的儿茶素组分含量大小依次为EGCG>C>ECG>EGC>EC>GC>CG> GCG，与茶叶植物相比，儿茶素总量和酯型儿茶素含量上低于茶叶植物，但非酯性儿茶素含量接近，保持在40～50 mg·g-1。从结构上看，酯型儿茶素与非酯型儿茶素的区别仅在于C环3位上有无没食子酰基化（刘亚军，2011），该部分的代谢机理可利用秃房茶和茶种结合，进一步探究秃房茶的遗传演化路径，并挖掘优异基因和特异种质。总之，本研究仅围绕秃房茶生化品质含量变化展开，明确了其嘌呤生物碱的组成特点和茶多酚、儿茶素、氨基酸、黄酮等主要生化品质的含量规律。本研究表明秃房茶的嘌呤生物碱组成及配比、酯型儿茶素含量等存在显著特异性，为不同风味及功能茶开发提供物质基础，并在茶树种质资源、茶叶加工、品种选育、功能性成分开发、次生代谢机理等方面将发挥重要作用。

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