气相色谱法同时测定麝香追风止痛膏中5种挥发性成分的含量

黄传俊 陈云 曾博程 刘勇 曾凡华 王文娟 叶修文 杜君 代晓进 杨红菊 谯志文 周年华

摘 要 目的：建立同時测定麝香追风止痛膏中5种挥发性成分含量的方法。方法：采用气相色谱法，色谱柱为PEG-20M毛细管柱，检测器为氢火焰离子化检测器，载气为氮气（纯度：99.999%），柱流量为1.5 mL/min，吹扫流量为3.0 mL/min，分流比为5 ∶ 1，进样口温度为200 ℃，检测器温度为250 ℃，程序升温，进样量为2 μL，尾吹流量为40 mL/min。结果：樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑、水杨酸甲酯检测质量浓度线性范围分别为19.78～247.26 μg/mL（r=0.999 6）、15.88～198.52 μg/mL（r=0.999 9）、8.60～107.56 μg/mL（r=0.999 9）、20.11～251.32 μg/mL（r=0.999 8）、12.09～151.11 μg/mL（r=0.999 3）；定量限分别为329.68、264.69、143.41、335.09、402.96 ng/mL，检测限分别为98.90、79.41、43.02、100.53、120.89 ng/mL；中间精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于3%；加样回收率分别为97.85%～101.52%（RSD=1.54%，n=6）、99.55%～103.75%（RSD=1.38%，n=6）、98.88%～104.23%（RSD=1.94%，n=6）、 98.11%～102.64%（RSD=1.92%，n=6）、96.55%～99.61%（RSD=1.44%，n=6）；耐用性试验的RSD均小于3%。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性、耐用性好，可用于麝香追风止痛膏中5种挥发性成分含量的同时测定。

关键词 麝香追风止痛膏；樟脑；龙脑；异龙脑；薄荷脑；水杨酸甲酯；气相色谱法；含量测定

中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）14-1931-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.14

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of 5 volatile constituents in Shexiang zhuifeng zhitong plaster. METHODS： Gas chromatography was adopted. The determination was performed on PEG-20M capillary column with flame ionization detector as detector，nitrogen （99.999%） as carrier gas， with column flow rate of 1.5 mL/min， purge flow of 3.0 mL/min， split ratio of 5 ∶ 1， injector temperature of 200 ℃， detector temperature of 250 ℃， temperature programming， sample size of 2 μL， tail blowing flow of 40 mL/min. RESULTS： The linear range of camphor， borneol， isoborneol， menthol and menthyl salicylate were 19.78-247.26 μg/mL（r=0.999 6）， 15.88-198.52 μg/mL （r=0.999 9）， 8.60-107.56 μg/mL（r=0.999 9）， 20.11-251.32 μg/mL （r=0.999 8）and 12.09-151.11 μg/mL （r=0.999 3）， respectively. The limits of quantitation were 329.68，264.69， 143.41， 335.09， 402.96 ng/mL； the limits of detection were 98.90， 79.41， 43.02， 100.53， 120.89 ng/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3%. The recoveries were 97.85%-101.52%（RSD=1.54%，n=6）， 99.55%-103.75%（RSD=1.38%，n=6）， 98.88%-104.23%（RSD=1.94%，n=6）， 98.11%-102.64%（RSD=1.92%，n=6）， 96.55%-99.61%（RSD=1.44%，n=6）， respectively. RSDs of durability test were all lower than 3%. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable，reproducible and durable， and can be used for simultaneous determination of 5 volatile constituents in Shexiang zhuifeng zhitong plaster.

KEYWORDS Shexiang zhuifeng zhitong plaster； Camphor； Borneol； Isoborneol； Menthol； Menthyl salicylate； GC； Content determination

麝香追风止痛膏由麝香追风止痛流浸膏、樟脑、冰片、薄荷脑、水杨酸甲酯、芸香浸膏、颠茄流浸膏等为主药，加以橡胶、松香、氧化锌、凡士林、羊毛脂、液体石蜡等基质制成。其中，麝香追风止痛流浸膏由人工麝香、生草乌、生川乌、乳香、没药、生马钱子、丁香、肉桂、荆芥、防风、老鹳草、香加皮、积雪草、骨碎补、白芷、山柰、干姜等药材提取加工而成。该贴膏剂具有祛风除湿、散寒止痛的功效[1]，临床上广泛用于急、慢性软组织损伤、关节扭伤、肩周炎、颈椎病、腰腿疼痛、肌肉痛等症的治疗[2-4]。由于该制剂所含的樟脑、冰片（龙脑和异龙脑）、薄荷脑、水杨酸甲酯均为挥发性成分，在对疗效产生贡献[5-6]的同时，也显著影响制剂质量的稳定性，因此如何控制好上述挥发性成分的含量非常关键。

已有研究对该制剂（原名：麝香止痛膏）中樟脑进行了定量分析，同时对樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯、桂皮醛、丁香酚、麝香酮等各成分进行了鉴定[7]；也有研究就该制剂中麝香酮、桂皮醛、薄荷脑进行了稳定性考察[8]。但上述研究对各挥发性成分定量分析不全面，参考价值有限。本研究采用气相色谱法同时测定该制剂中樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑、水杨酸甲酯5种挥发性成分的含量，样品分析时间约25 min，较已有文献报道的分析时间大幅缩短，各组分峰之间分离度好，峰形尖锐、对称，能更好地控制麝香追风止痛膏的内在质量。现将有关情况报道如下。

1 材料

1.1 仪器

GC-2014型气相色谱仪，包括氢火焰离子化检测器（FID）、AOC-20i自动进样器、Lab Solutions色谱工作站（日本Shimadzu公司）；CP225D型电子分析天平、BS124S型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 药品与试剂

麝香追风止痛膏（重庆希尔安药业有限公司，批号：160701、160801、161001、161201、170101、170201、170301、170501、171001、171201，规格：每片7 cm×10 cm）；樟脑对照品（批号：110747-201409，纯度：98.7%）、龙脑对照品（批号：110881-201507，纯度：96.8%）、异龙脑对照品（批号：111512-200802，纯度：97.5%）、薄荷脑对照品（批号：110728-201506，纯度：96.2%）、水杨酸甲酯对照品（批号：110707-201413，纯度：99.7%）均购于中国食品药品检定研究院；正十四烷对照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：H1618002，纯度：99.5%）；试验所用试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：PEG-20M毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；检测器：FID；载气：氮气（纯度：99.999%）；柱流量：1.5 mL/min；吹扫流量：3.0 mL/min；分流比：5 ∶ 1；进样口温度：200 ℃；检测器温度：250 ℃；升温程序：初始温度为110 ℃，保持13 min，以30 ℃/min的速率升至160 ℃，保持9 min；进样量：2 μL；尾吹流量：40 mL/min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标溶液 精密称取正十四烷对照品351.63 mg，加乙酸乙酯溶解，制成正十四烷质量浓度为3.498 7 mg/mL 的内标溶液。

2.2.2 混合对照品溶液 分别精密称取樟脑对照品62.63 mg、龙脑对照品51.27 mg、异龙脑对照品27.58 mg、薄荷脑对照品62.83 mg、水杨酸甲酯对照品37.89 mg，各置于25 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容，摇匀，得单一对照品溶液。分别精密量取上述樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑、水杨酸甲酯单一对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，置于同一25 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”项下内标溶液1 mL，加乙酸乙酯定容，摇匀，得混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 取样品1片，除去盖衬，剪成小块，置于具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯50 mL，密塞，静置30 min，摇匀；精密量取溶液20 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”项下内标溶液1 mL，加乙酸乙酯定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液 按麝香追风止痛膏处方和工艺制备缺樟脑、冰片、薄荷脑和水杨酸甲酯的阴性样品，并按“2.2.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样測定，记录色谱，详见图1。结果，阴性对照溶液在樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑、水杨酸甲酯和正十四烷等各成分相应的保留时间处无干扰峰，表明本方法专属性良好。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下单一对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”项下内标溶液1 mL，加乙酸乙酯定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各2 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以内标物与待测成分质量浓度比（x，c内/c待）为横坐标、峰面积比（y，A内/A待）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

2.5 定量限与检测限考察

分别精密量取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑、水杨酸甲酯定量限分别为329.68、264.69、143.41、335.09、402.96 ng/mL，检测限分别为98.90、79.41、43.02、100.53、120.89 ng/mL。

2.6 中间精密度试验

由2名分析员在不同日期取样品（批号：170201）适量，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件在不同仪器上进样测定，记录峰面积并计算样品含量及RSD，结果见表2。

2.7 稳定性试验

取“2.2.3”项下供试品溶液（批号：170201）5份，分别于室温下放置0、2、4、6、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑、水杨酸甲酯峰面积的RSD分别为 1.72%、1.08%、1.22%、0.96%、1.95%（n=5），表明供试品溶液在室温下放置8 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取样品（批号：160701）适量，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑、水杨酸甲酯含量平均值分别为16.64、8.47、4.97、13.21、12.85 mg/片，RSD分别为2.22%、1.74%、1.95%、1.69%、2.15%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量样品（批号：160701）1片，按规格尺寸平均分成2小片，取其中一小片，除去盖衬，剪成小块，置于50 mL量瓶中，分别加入一定量的各待测成分单一对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.10 耐用性试验

2.10.1 色谱柱考察 取样品（批号：160701）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件[分别设置色谱柱为Shimadzu RTX-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、AT·PEG-20M（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、Phenomenex ZB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）]进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。结果表明，当色谱柱发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，表明耐用性良好。

2.10.2 尾吹流量考察 取样品（批号：160701）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（分别设置尾吹流量为35、40、45 mL/min）进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。结果表明，当尾吹流量发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，表明耐用性良好。

2.10.3 进样口温度考察 取样品（批号：160701）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（分别设置进样口温度为195、200、205 ℃）进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。结果表明，当进样口温度发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，表明耐用性良好。

2.10.4 检测器温度考察 取样品（批号：160701）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（分别设置检测器温度为245、250、255 ℃）进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。结果表明，当检测器温度发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，表明耐用性良好。

2.11 样品含量测定

取10批样品各适量，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量，结果见表5。

3 讨论

本课题组在确定色谱条件时，参考文献[9-14]，分别考察了不同提取溶剂、升温程序、内标物对测定结果的影响。结果发现，以乙酸乙酯作提取溶剂时，有效成分可充分溶解，待测成分含量较以石油醚作提取溶剂时高；以30 ℃/min的升温速率，25 min即可完成1次分析，与已有报道[15-17]比较缩短了分析时间；以正十四烷为内标时，待测成分及内标峰与相邻峰之间分离度好，峰形尖锐、对称性好，色谱结果较以萘为内标时[17]好。

樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑、水杨酸甲酯在超声提取时会随着温度的升高而挥发，本课题组考虑到这个问题，采取了易溶解上述5种成分的乙酸乙酯作为提取溶剂进行静置提取，并与冰水浴超声对比，发现含量无明显差异。考虑到静置提取干扰因素小，方法更简单，有效避免了样品中提取成分挥发而对测定结果产生影响，故最终采用乙酸乙酯静置提取挥发性成分。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性、耐用性好，可用于麝香追风止痛膏中樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑和水杨酸甲酯5种挥发性成分含量的同时测定。

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（收稿日期：2018-02-12 修回日期：2018-04-18）

（编辑：张 静）