不同产地梅花鹿鹿茸药材中5种核苷类成分的含量测定及聚类分析

刘雪莹 赵雨 何慧楠 李雪惠 刘莉 齐滨

摘 要 目的：建立同時测定梅花鹿鹿茸药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷 5 种核苷类成分含量的方法，并比较不同产地梅花鹿鹿茸药材中上述核苷类成分含量的差异。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为甲醇-0.07%冰醋酸溶液（4 ∶ 96，V/V），流速为1.0 mL/min， 检测波长为254 nm，柱温为28 ℃，进样量为5 μL。采用SPSS 19.0软件对30批不同产地梅花鹿鹿茸药材（S1～S30）进行聚类分析。结果：尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的检测质量浓度线性范围均为0.001～0.01 mg/mL（r均为0.999 9）；定量限分别为1.489 1、1.927 9、4.880 9、7.884 6、8.092 1 ng，检测限分别为0.446 7、0.578 4、1.464 3、2.365 4、2.427 7 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；加样回收率分别为99.69%～103.65%（RSD=1.40%，n=9）、97.77%～103.26%（RSD=1.67%，n=9）、97.82%～101.81%（RSD=1.12%，n=9）、99.30%～104.82%（RSD=1.72%，n=9）、98.13%～100.20%（RSD=0.64%，n=9）。30批药材样品中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的含量存在差异。上述药材样品可聚为3大类，即S16～S18、S22～S30聚为一类，S8～S15、S19～S21聚为一类，S1～S7聚为一类。结论：该方法精密度、稳定性、重复性均较好，可用于同时测定梅花鹿鹿茸药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的含量；梅花鹿鹿茸药材的质量受生态环境、养殖技术等因素的影响，存在较大差异。

关键词 梅花鹿鹿茸；尿嘧啶；次黄嘌呤；尿苷；肌苷；鸟苷；高效液相色谱法；含量测定；聚类分析

中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）14-1945-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.17

ABSTRACT OBJECTIVE： To set up a method for simultaneous determination of 5 nucleosides as uracil， hypoxanthine， uridine， creatinine and guanosine in Cervus nippon， to compare the differences of above nucleosides content in C. nippon among different producing areas. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Aglient Eclipse Plus C18 column with methanol-0.07% glacial acetic acid （4 ∶ 96，V/V） as mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 254 nm. The column temperature was set at 28 ℃， and sample size was 5 ?L. Cluster analysis was conducted for 30 batches of C. nippon from different producing areas by using SPSS 19.0 software. RESULTS： The linear ranges of uracil， hypoxanthine， uridine， creatinine and guanosine were 0.001-0.01 mg/mL （all r≥0.999 9）. The limits of quantitation were 1.489 1， 1.927 9， 4.880 9， 7.884 6， 8.092 1 ng， and the limits of detection were 0.446 7， 0.578 4， 1.464 3， 2.365 4， 2.427 7 ng， respectively. RSDs of precision， stability， reproducibility tests were lower than 2%. The recoveries were 99.69%-103.65%（RSD=1.40%，n=9），97.77%-103.25%（RSD=1.67%，n=9）， 97.82%-101.81%（RSD=1.12%， n=9）， 99.30%-104.82%（RSD=1.72%，n=9） and 98.13%-100.20%（RSD=0.64%，n=9）. The contents of uracil， hypoxanthine， uridine， creatinine and guanosine were significantly different in 30 batches of C. nippon， which were clustered into 3 categories. S16-S18 and S22-S30 were clustered into one category； S8-S15 and S19-S21 were clustered into one category； S1-S7 were clustered into one category. CONCLUSIONS： The method has good precision， stability and reproducibility. It is suitable for simultaneous determination of uracil， hypoxanthine， uridine， creatinine and guanosine in C. nippon. The quality of C. nippon has great difference due to ecological environment and technical factors of farming.

KEYWORDS Cervus nippon； Uracil； Hypoxanthine； Uridine； Creatinine； Guanosine； HPLC； Content determination； Cluster analysis

鹿茸为鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或马鹿（Cervus elaphus Linnaeus）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。梅花鹿鹿茸因具有改善神经功能及性功能障碍，抗疲劳、抗衰老、抗氧化等药理作用[2-3]，而奠定了其在医药及保健领域的地位。 目前，梅花鹿鹿茸的药效成分未明确，在加工、质量评定、真伪鉴别等工作中，缺少以化学成分作为指标的科学标准，因而制约了其深入开发与利用。

相关调查数据显示，我国市场上的鹿茸药材约有 80%产于梅花鹿[4]。由于受药材来源、生态环境、市场供需等因素的影响，使大量的梅花鹿鹿茸易混品与伪品流入了药材市场，因此建立全面、系统地控制梅花鹿鹿茸药材质量的分析方法十分必要。鹿茸中主要含有脂类、多糖、多胺、蛋白质及多肽、激素样物质、生物碱类、核苷类等多种化学成分[5-7]。鹿茸中核苷类成分是抗衰老的主要成分之一，包括尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷等。有研究表明，次黄嘌呤可抑制与神经系统老化有关的单胺氧化酶的活性，从而发挥抗氧化及抗衰老的作用[8]；核苷类成分具有调节免疫功能、促进肠道修复、降血压、抗心律失常、抗缺血性损伤、保肝、镇静等生物活性[9]。因此，该类成分与鹿茸的生物活性有一定的关联，可作为鹿茸药材的质量评价指标之一。而目前，对不同产地的梅花鹿鹿茸药材中核苷类成分的系统研究尚未见报道。为此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定了14个省（区）的30批梅花鹿鹿茸药材样品中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷5种核苷类成分的含量，并通过聚类分析比较了不同产地药材样品的含量差异，从而为筛选优良种质资源、规范养殖和制订相关质量标准提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-2030型HPLC仪，包括四元泵、真空脱气机、自动进样器、紫外-可见光检测器、柱温箱、色谱工作站 （日本岛津公司）；DZF-6050型电热恒温真空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；Eppendorf 5920R型低速离心机（德国艾本德公司）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； MS204S 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试剂

尿嘧啶对照品（批号：140669-201305）、肌苷对照品（批号：100469-201302）均由中国食品药品检定研究院提供；次黄嘌呤对照品（批号：B20211）、尿苷对照品（批号：B20907）、鸟苷对照品（批号：B20905）均由上海源叶生物科技有限公司提供，经 HPLC 峰面积归一化法计算纯度均不低于98%；甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

梅花鹿鹿茸药材样品（编号：S1～S30）经长春中医药大学药学院姜大成教授鉴定为鹿科动物梅花鹿（C. nippon Temminck）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。藥材样品来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：甲醇-0.07%冰醋酸溶液（4 ∶ 96，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：28 ℃；进样量：5 μL。在该色谱条件下，理论板数以次黄嘌呤峰计应不低于10 000，分离度均大于1.5，阴性对照对测定无干扰，详见图 1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取尿嘧啶对照品、次黄嘌呤对照品、尿苷对照品、肌苷对照品、鸟苷对照品各5 mg，置于50 mL量瓶中，加水稀释并定容，摇匀，得单一对照品溶液。精密量取上述单一对照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加水定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得各成分质量浓度均为0.01 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取干燥的药材样品细粉（过四号筛）0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加水7.5 mL，超声（功率：250 W，频率：40 kHz，下同）提取30 min后，10 000 r/min离心10 min，分离提取液后，残渣再超声提取1次。 合并2次提取液，置于50 mL量瓶中，加水定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 以4%甲醇为阴性对照溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加水定容，摇匀，即得系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分检测质量浓度（x，mg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。

2.4 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。按信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的定量限分别为1.489 1、1.927 9、4.880 9、7.884 6、8.092 1 ng，检测限分别为0.446 7、0.578 4、1.464 3、2.365 4、2.427 7 ng。

2.5 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷峰面积的RSD 分别为0.06%、0.06%、0.08%、0.09%、0.09%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S6）适量，分别于室温下放置0、2、6、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷峰面积的RSD 分别为0.09%、0.30%、0.21%、0.18%、0.31%（n=6），表明供试品溶液室温放置24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取药材样品（编号：S6）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷含量的RSD分别为0.65%、0.45%、0.72%、1.13%、0.87%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量药材样品（编号：S6）细粉约0.50 g，共 9 份，精密称定，加入一定量的各单一对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.9 样品含量测定

取30批药材样品细粉各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按 “2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

2.10 聚类分析

采用 SPSS 19.0软件对药材样品进行聚类分析。采用离差平方和法，以平方欧式距离为区间进行聚类，结果见图2；各大类样品中5种核苷类成分平均含量见表5。由图2、表5可知， 30 批药材样品可聚为3大类： S16～S18、S22～S30聚为一类，此类药材样品中5 种核苷类成分的含量均小于总体平均值；S8～S15、S19～S21聚为一类，此类药材样品中5 种核苷类成分的含量与总体平均值相差不大；S1～S7聚为一类，此类药材样品中尿嘧啶、尿苷含量明显高于总体平均值，其他核苷类成分含量略高于总体平均值。这提示，不同产地的药材样品中5种核苷类成分含量存在差异，其中以S1～S7药材样品中核苷类成分含量最高。

3 讨论

在预试验中，笔者通过比较超声、回流、振荡3种提取方法，发现超声法提取率最高，最终选择以超声法提取样品。通过比较不同溶剂（甲醇、乙醇、水），发现甲醇、乙醇为溶剂时最大吸收峰峰形欠佳，故选择以水为提取溶剂。通过比较不同溶剂用量（10、15、20倍），发现15倍水提取时提取率最高且不再增加，故选择溶剂用量为15倍水。通过比较不同提取时间（30、45、60 min）、提取次数（2、3、4次），发现提取时间30 min、提取3次的提取率最高，故选择提取时间30 min、提取次数3次。

在预试验中，通过对不同色谱柱Agilent TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Aglient Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、岛津ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行比较，发现采用Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）对5种核苷类成分均可达到良好的分离。通过以甲醇-水、乙腈-水为流动相进行比较，发现流动相为甲醇-水（4 ∶ 96，V/V）时次黄嘌呤与尿苷色谱峰不能较好地分离；又尝试加入不同比例的冰醋酸，發现加入0.07%冰醋酸后，峰形得到改善，可实现5种核苷类成分色谱峰均较好地分离。确定检测波长为254 nm、柱温为28 ℃时，尝试对不同流速（1.0、0.8、0.5 mL/min）进行比较，发现当流速为1 mL/min时，5种核苷类成分能在20 min内快速分离。确定流速1 mL/min、检测波长254 nm时，尝试对不同柱温（28、30、35 ℃）进行比较，发现当柱温为28、35 ℃时，出峰时间均较快，故选择柱温28 ℃。

本研究结果显示，5种核苷类成分含量以吉林地区和黑龙江地区药材样品最高，其他省（区）药材样品中上述核苷类成分的含量相对较低，但同一地区的药材样品中上述核苷类成分含量差别不大。这可能与梅花鹿养殖技术和当地的生态环境有关。

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（收稿日期：2018-01-31 修回日期：2018-05-21）

（编辑：陈 宏）