正交试验法优选超声提取溪黄草中齐墩果酸的工艺研究

龚先玲，何银妹，陈志红，李燕秋

(1.广东医科大学药学院，东莞 523808； 2.广东医科大学分析中心，东莞 523808)

溪黄草为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜Rabdosialophanthoides(Buch-Ham ex D Don) Hara的干燥全草[1]，具有清热利湿、凉血散瘀、退黄祛湿等功效，临床上用于治疗急性肝炎、胆囊炎和跌打瘀肿等症[2，3]。其叶和茎中含有多种化合物，如溪黄草素A、溪黄草素B、溪黄草素D、熊果酸、尾叶香茶菜素A、2α-羟基熊果酸、β-谷甾醇苷、齐墩果酸、β-谷甾醇、线纹香茶菜、Gerardianin B和C等[1，2,4-6]。其中，齐墩果酸属于五环三萜类化合物，具有多种显著的生物活性：如抑制肝癌细胞的生长、诱导细胞凋亡、抗菌、抗糖尿病、抗癌、抗肝脂肪变以及抗肝纤维化等作用[7-11]。齐墩果酸的提取常用超声提取法和微波提取法[12，13]，超声提取法具有提取时间短、节约溶剂、避免高温对提取成分的破坏等优点，此方法已被广泛用于中药有效成分的提取[14,15]，但用于提取溪黄草中的齐墩果酸仍未见报道。本文采用正交试验优选超声提取溪黄草中的齐墩果酸的工艺条件，为溪黄草的深入研究提供实验依据，并为齐墩果酸的来源与合理化生产提供新的参考方向。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国惠普公司 HP -1200 高效液相色谱仪；瑞士梅特勒公司 AE-240 型电子分析天平；KQ5200DB型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 齐墩果酸对照品购于宝鸡辰光生物科技有限公司 (批号20160701,含量大于98%)；乙腈为一级色谱纯，天津四友精细化学品有限公司生产；其他试剂均为分析纯；溪黄草购于东莞国药集团，产地广东清远，由广东医科大学苟占平博士鉴定为线纹香茶菜Rabdosialophanthoides(Buch-Ham ex D Don) Hara。

2 方法与结果

2.1 方法学考查

2.1.1 色谱条件 ODS C18分析色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm )，流动相乙腈-水-磷酸(400∶100∶0.84)，流速1.0 ml/min，DAD检测器，检测波长210 nm，柱温25 ℃,进样量20 μl。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品5.34 mg，加乙醇溶解后定容至100 ml，制成0.053 4 g/L的齐墩果酸对照品溶液。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取溪黄草4.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇40 ml，超声提取60 min(每20 min暂停一次)，放冷，滤过，移入100 ml量瓶中，用无水乙醇定容，0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，备用。

2.1.3 系统适应性试验 分别吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪， 按 “2.1.1” 项下色谱条件进行测定。结果供试品图谱中，齐墩果酸与其他成分峰能达到基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数大于3 000。结果见图 1。

1.齐墩果酸

2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取体积分别为4、8、12、16和20 μl的齐墩果酸对照品溶液，依次注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以齐墩果酸的进样量(μg)为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)作图，得回归方程Y=1 226 300.974X-41 012.876(r=0.999 0)，表明齐墩果酸的线性范围为0.213 6～1.068 μg，且线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取0.053 4 g/L 的对照品溶液20 μl，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，测定其峰面积，经计算得齐墩果酸的RSD为1.49%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精密称取同一批溪黄草样品6份，每份4.0 g，按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，各进样20 μl，测定其峰面积，结果RSD为1.68%，表明该方法重复性较好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，于0、2、4、6和12 h，各进样20 μl，测定其峰面积，结果RSD为1.33%，说明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的溪黄草样品4.0 g，共6份，每份加入“2.1.2.1”项下的0.053 4 g/L齐墩果酸对照品溶液10 ml，按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，计算加样回收率，结果齐墩果酸的平均回收率为97.16%，RSD为1.40%。见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验设计 以溪黄草中齐墩果酸的含量为指标，考查乙醇浓度(A)、提取时间(B)、溶剂倍数(C)、提取次数(D)4种因素对提取结果的影响，按L9(34) 进行正交试验设计，具体水平和因素见表2。

表2 溪黄草中齐墩果酸超声提取工艺正交试验设计

2.2.2 试验安排与结果 按照L9(34)正交试验安排表进行试验，精密称取溪黄草4.0 g，共9份，加相应体积的提取溶剂，超声提取，过滤，合并滤液，测定体积，得到1～9号待测溶液。将各待测液按“2.1.1”项下的色谱条件分别进样，测定峰面积，并计算齐墩果酸含量，结果见表3。

表3 溪黄草中齐墩果酸的

2.2.3 最佳提取工艺的确定 由表3的试验结果可知，A3>A2>A1，B3>B2>B1,C2>C3>C1，D3>D2>D1，A3B3C2D3所得齐墩果酸提取率最高，由此得最佳提取条件为A3B3C2D3，即用无水乙醇提取，料液比为1∶10，提取3次，每次60 min。根据直观分析结果，各因素对超声提取溪黄草中的齐墩果酸都有不同程度的影响，其中提取率均随着乙醇浓度、提取时间和提取次数的增加而升高，但料液比的梯度变化并没有使齐墩果酸的提取率呈现正相关或负相关变化，即料液比对齐墩果酸的提取影响不大。

方差分析用SPSS 22.0统计软件进行。由于在设计L9(34)正交试验时，没有设置误差项，因此，应把A、B、C、D中均方值最小的A项作为误差项来考查[16]，计算方差齐分析，结果见表4。由方差分析结果可知，四种因素对齐墩果酸提取率的影响程度依次为D>C>B>A，其中D因素显著影响齐墩果酸的提取率。由于B1与B3两水平对工艺影响的差异不显著，为了适应大批量生产，结合生产经验，生产工艺最终优化为：A3B1C2D3，即用10倍量的无水乙醇，每次超声20 min，共提取3次。

2.3 验证试验 精密称取3批不同批次的溪黄草各一份，每份4.0 g，按正交试验优选的提取工艺进行提取，即加40 ml的无水乙醇，每次20 min，超声提取，过滤，重复上述操作2次，合并滤液。HPLC法在“2.1.1”项色谱条件下测定含量，结果得每克溪黄草中齐墩果酸的平均含量为520.06 μg，的RSD为1.41%，重现性良好。

表4 方差分析结果

3 讨论

正交试验法是一种多因素、多水平的试验设计方法，当设计要求的试验次数太多时，正交试验不仅减少了工作量，减少了时间，还节省试验耗材，降低试验成本。本试验为四个三水平因子的试验，若进行全面试验则需要做34=81次试验，而用L9(34)只需9次。而且试验时间越长干扰越多，因此与全面试验相比，正交试验缩短了试验周期，提高了试验的精确度，因此本试验采用正交试验法，高效、经济、精确。

本试验通过内标法对溪黄草中齐墩果酸的含量进行定量分析，HPLC流动相为乙腈-水-磷酸(400∶100∶0.84)，齐墩果酸的检测波长为210 nm，标准品的线性相关系数r为0.999 0，方法学验证中，仪器的精密度、方法的重复性与试样的稳定性均良好，加样回收率在95.79%～99.24%，该方法经济、简单、高效、重现性好，对检测溪黄草中的齐墩果酸含量是较为适宜的方法。

由试验结果可以看出，提取次数对溪黄草中齐墩果酸的提取率影响最大，其次是料液比和提取时间，乙醇浓度对提取率的影响最小。因此结合生产实际，从降低耗能、节省时间等方面考虑，最终确定提取齐墩果酸的最佳方法是：用无水乙醇提取，提取时间为每次20 min，料液比1∶10，提取3次，即最优的生产工艺是A3B1C2D3。按照最佳的生产工艺条件，进行优化工艺的验证试验, 此工艺条件得到较高的提取率，具有节省成本、提取效率高等优点。