杂交鳢疑似流行性溃疡综合征的诊断

■ 文｜中国水产科学研究院珠江水产研究所 常藕琴 刘春 张德锋 王亚军 廖国礼 王庆 石存斌

流行性溃疡综合征（Epizootic Ulcerative Syndrome，EUS）是由真菌媒介丝囊霉菌（Aphanomycesinvadans）引起野生及养殖淡水与半咸水鱼类体表溃疡、骨骼肌形成典型霉菌性肉芽肿的一种季节性流行病。该病在生产中常容易误诊为细菌、病毒性疾病而忽略防治。目前全球至少有26个国家发现该病，感染鱼类有100多种，EUS已引起世界各国关注。

杂交鳢（Channa maculata♀×C.argus♂）肉质细嫩，味道鲜美，其蛋白质含量高，营养价值高。近年来，在珠江三角地区养殖规模逐步扩大，成为重要的淡水经济鱼类养殖品种。2012年以来，珠江三角地区许多淡水养殖场杂交鳢暴发了主要症状为体表溃疡的疾病，大块损伤多发生在躯干和背部，严重病例头盖骨软组织和硬组织也形成溃疡灶，更有甚者尾部溃烂断裂。该病多暴发于低水温期和降大雨之后，发病率达 80%，死亡率达90%以上，幸存者也因体表溃烂，外观丑陋，严重影响销售，对杂交鳢养殖造成巨大经济损失。本文从病理组织学角度，对发病鱼的溃疡组织进行病原分离和形态观察，同时对其病变组织进行活体压片和病理组织观察和诊断，初步确认为溃疡综合症，为临床诊断、病理学研究及疾病的预防提供基础依据。

图1 杂交鳢流行性溃疡综合症外观

1.材料与方法

1.1 病鱼来源

发病鱼样本采自广东佛山市某淡水杂交鳢养殖场，体质量 500g左右。发病期间水温 15～20℃，主要症状为体表溃疡。

1.2 活组织压片和组织病理材料的制备

取自然发病鱼的溃疡灶，活体压片，光学显微镜观察。取发病鱼溃疡灶，用 Bouin氏液固定 24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。RM-2135型 Leica轮转式切片机连续切片，厚度为 3～5μm，HE常规染色和 Grocott六胺银染色，Nikon-e80显微镜观察和摄影。

1.3 病原分离与观察

从自然发病鱼的溃疡灶处无菌切取 2～4mm2的小片肌肉，置真菌肉汤培养基，25℃培养 12h，将出现的菌丝转移到新鲜的真菌琼脂平板上，直到平板无其他污染菌为止。取带有生长活力菌丝的一小块琼脂（直径3～4cm），置于肉汤中 20℃孵育 4d，用灭菌的池塘水洗5次，然后于其中20℃过夜。大约 12h后观察原代孢囊群落的形成。Nikon倒置显微镜下观察，显微摄影。

2.结果

2.1 临床症状

患病初期，病鱼反应迟钝，食欲下降，鱼体发黑，病鱼漂浮水面上，有时不停地异常游动，体表无明显症状；随着病情发展，病鱼体表、头、鳃盖或尾部可见红斑，周围充血红肿；随后出现较大红色或灰色的浅部溃疡，大块损伤多发生在躯干和背部；严重病例头盖骨软组织和硬组织坏死，脑部和内脏裸露（图1），在疾病后期病灶表面丛生菌丝，逐渐死亡。

2.2 活组织压片和组织学观察

活体压片观察到溃疡肌肉组织中有大量霉菌样微生物，菌丝纤细，很少分支，直径约10～20μm（图2-1）。

光学显微镜观察 HE染色溃疡灶有典型的肉芽肿结节，肌纤维溶解断裂，其间有大量的霉菌性结节，结节中央是霉菌样菌丝，外围包裹上皮样细胞和结缔组织（图2-2）；Grocott六胺银染观察到溃烂组织有大量的截面大小不等的褐色或棕色的真菌菌丝，这些霉菌样菌丝有些被横切呈圆形，截面较小；有些被斜切或纵切，呈丝状，截面较大（图2-3）。

图2 丝囊霉菌样微生物形态和组织学观察

2-1 活体压片组织中的真菌 (☆ )，标尺100μ；2-2 侵袭到肌肉组织中的霉菌形成的肉芽肿结节（☆），H&E，标尺 100μ；2-3 肌肉组织及肉芽肿结节中侵袭的真菌（☆），Grocott六胺银染色，标尺 200μ；2-4 菌丝顶端排列较多的孢子形成孢子囊（蓝箭头）和释放出来的动孢子堆积在菌丝周围（箭头），标尺100μ。

2.3 病原分离与形态观察

无菌操作下，病变组织于肉汤培养基培养 12h，显微镜下观察到分枝较少的纤细丝状菌丝，直径约 10～20μm，菌丝中没有横膈膜。菌丝置无菌塘水中 20℃过夜，镜下可观察到孢子在菌丝中分段排列，并有一定的间隔。孢子囊由不特化的菌丝形成，菌丝顶端孢子排列较多，形成孢子囊。肉汤中 20℃孵育 4d，形成的原代孢子群。有些动孢子释放出来，不散开，堆积在菌丝周围，有些则分散在水中（图2-4）。

3.讨论

资料报道鱼类溃疡病可分离出气单胞菌属、产碱杆菌属、假单胞菌、弧菌、弹状病毒、双 RNA病毒和丝囊霉菌等病原。本研究发病杂交鳢大部分体表溃疡，主要在体侧、背部、尾部或鳃盖和头顶部，溃疡处有呈红色，有呈灰白色，有些肌肉溃烂严重，骨骼裸露，与流行性溃疡综合症临床症状相似。依据临床症状，病原形态、原代孢囊群落形成特征和组织学观察，初步诊断为丝囊霉菌引起的流行性溃疡综合征。

水产动物养殖中，溃疡综合征在低温下发病，一般认为在自然情况下，发病可能是由于集约化程度高，养殖密度过大，致使鱼体容易损伤和体质下降，给病原菌提供了致病机会。目前对丝囊霉菌传播途径、致病机理和防治研究报道极少。因此对该病的传播途径、早期诊断、快速检测、致病机理和预防治疗等方面作进一步研究具有重要意义。