棘托竹荪干子实体与菌丝体抑菌作用的比较研究

谌斌，于方明，何欢，陆兵

(1.广西高校岩溶生态与环境变化研究重点实验室，广西 桂林 541004；2.广西师范大学环境与资源学院，广西 桂林 541004；3.桂林淮安天然保健品开发有限公司，广西 桂林 541004)

竹荪隶属于腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、竹荪属，常见并可供食用的有4种：长裙竹荪、短裙竹荪、红托竹荪和棘托竹荪。竹荪有着很高的营养价值和药用功效，其子实体中含有21种氨基酸以及多种维生素，同时它也富含多糖和多种微量元素[1-3]，因而具有增强免疫力、抗肿瘤、抗衰老等作用[4-6]。另外，竹荪对食品防腐有奇效，“与肉共食,味鲜防腐”，在夏季加入竹荪的煮熟菜肴可以保持较长时间不腐败变质，究竟是什么成分在起作用，目前尚不清楚[7]。

竹荪抑菌作用的研究目前主要集中在竹荪干子实体有机溶剂提取液对细菌和真菌的抑制作用上，如檀东飞等对棘托竹荪菌盖的化学成分及抑菌作用进行了研究，结果表明棘托竹荪菌盖的挥发油对细菌、霉菌、酵母菌有抑制作用[8-10]。而以棘托竹荪菌丝体作为一种新型食品防腐剂的研究报道不多。棘托竹荪是我国科学工作者于1986年在湖南省会同县首次发现，并于1988年定名的竹荪新种。该菌香气浓郁，味道鲜美，现已在我国南方一些地区大面积栽培。本文就此进行了棘托竹荪干子实体与菌丝体抑菌作用的比较研究，以期为将棘托竹荪菌丝体开发为天然食品防腐剂奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

棘托竹荪(Dictyophoraechinovolvata)：购自华中农业大学食用菌研究中心；抗菌性供试菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、黑曲霉(Aspergillusniger)、绿色木霉(Trichodermaviride)等：由本实验室保藏。

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2，用于培养细菌。

综合PDA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，磷酸二氢钾3 g，七水硫酸镁1.5 g，琼脂20 g，自然pH，培养棘托竹荪、酵母菌和霉菌用。

1.3 主要试剂

乙醇、丙酮、乙酸乙酯：均为国产分析纯试剂。

1.4 棘托竹荪干子实体

购自广西桂林市七星农贸市场，50 ℃烘干并用粉碎机粉碎后备用。

1.5 方法

1.5.1 菌株的活化

将保藏于冰箱中的上述菌种接种于相应斜面培养基上，置于生化培养箱中培养，培养好后置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.5.2 平板培养基制备

配制好的固体培养基，于121 ℃高压蒸汽灭菌后，冷却至45 ℃，在超净工作台中将其倾注于无菌的培养皿中，每皿15 mL，凝固后备用。

1.5.3 供试菌株菌悬液的制备及平板接种

用接种针或接种环在无菌室中挑取细菌和真菌少许斜面培养物于装有9 mL无菌水的试管中，制成菌悬液。大肠杆菌和枯草杆菌，用比浊法计数，酵母菌和霉菌孢子用血球计数板计数。调整菌悬液的浓度至含细胞数或孢子数106～107个/mL，用移液枪移取0.1 mL菌悬液于平板培养基上，用无菌三角刮铲将菌液均匀涂布。

1.5.4 棘托竹荪干子实体提取液的制备

用电子天平称取6.00 g棘托竹荪干子实体，分成三等份各2.00 g装于三角锥形瓶中(分别编号为1,2,3)。在1号锥形瓶中装入50 mL乙醇，2号锥形瓶中装入50 mL丙酮，3号锥形瓶中装入50 mL乙酸乙酯，置于28 ℃恒温培养箱浸泡18 h，过滤并保留滤液，滤渣再各加入50 mL乙醇、丙酮、乙酸乙酯浸泡18 h，过滤后的滤液与前一次的滤液合并。将滤液加热浓缩后分别得到不同有机溶剂的棘托竹荪干子实体提取液[11,12]。

1.5.5 滤纸圆片测试培养

用打孔器将新华一号定性滤纸打成直径6 mm的小圆纸片，放进培养皿中121 ℃高压蒸汽灭菌，将灭菌滤纸片分别浸入不同的棘托竹荪子实体浸提液中浸透。将浸好的滤纸片贴在制备好的接种平板上，将培养皿一分为二，一边贴提取液滤纸片，一边贴无菌蒸馏水空白对照滤纸片，每边3片[13]。贴好滤纸片的平板置于恒温培养箱中培养，细菌于35～37 ℃培养18～24 h，霉菌、酵母菌44～48 h，测量抑菌圈直径。

1.5.6 棘托竹荪菌丝培养及其提取液抑菌试验

将活化后的棘托竹荪斜面菌种菌丝接种于铺有玻璃纸的PDA平板上，28 ℃培养12天，从玻璃纸刮下培养好的菌丝体并置于三角锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯在28 ℃条件下浸提菌丝体18 h，过滤并保留滤液，滤渣再加入50 mL乙酸乙酯浸泡18 h，过滤后的滤液与前一次的滤液合并，将滤液加热浓缩后得到棘托竹荪菌丝体提取液，采用滤纸圆片法进行棘托竹荪菌丝体提取液抑菌试验，同时进行棘托竹荪干子实体提取液抑菌试验。

1.5.7 食物防腐试验

将猪肉、豆腐、土豆切成小块并等分成5份，分别加入棘托竹荪湿子实体粉及其浸提液、棘托竹荪菌丝体及其浸提液、冷开水(作为对照样)，烹熟，置于35～37 ℃下保温48 h，肉眼观察食物的动态变化[14]。

2 结果与讨论

2.1 棘托竹荪干子实体提取液抑菌作用

棘托竹荪干子实体提取浓缩液呈浅黄色，有棘托竹荪的清香味，抑菌试验的结果表明棘托竹荪干子实体提取液对细菌和真菌都有抑制作用，特别是对细菌有很强的抑制效果；棘托竹荪子实体不同提取液对细菌和真菌的抑制效果有差别，乙酸乙酯提取液的抑制作用最强，供试菌株被抑制的程度大小依次是：大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉、绿色木霉(见表1)。说明棘托竹荪干子实体提取液中含有抗菌活性物质，具体的有效成分及其抑菌机理有待以后进一步研究探讨。

表1 棘托竹荪干子实体提取液的抑菌作用

注：+表示有抑菌作用，随着+增加表示抑菌作用越大，-表示无抑菌作用。

2.2 棘托竹荪菌丝体乙酸乙酯提取液的抑菌作用

棘托竹荪菌丝体的乙酸乙酯提取液对细菌和真菌有抑制作用，抑制效果和其干子实体乙酸乙酯提取液的抑菌效果差不多(见表2)，而棘托竹荪子实体栽培时间长达3～4个月，且需占用大面积土地,而通过深层培养或固态静止培养可快速获得棘托竹荪菌丝体，为进一步开发利用棘托竹荪菌丝体的有效抑菌活性成分提供一定的科学依据和可能。

表2 棘托竹荪菌丝体与干子实体浸提液的抑菌作用

注：+表示有抑菌作用，随着+增加表示抑菌作用越大，-表示无抑菌作用。

2.3 食物防腐试验

食物防腐试验的效果见表3。

表3 食物防腐试验

由表3可知，3种食物的对照系列均有不同程度的腐烂，尤其是肉类，加入冷开水的具有恶臭味。3种食物中加入棘托竹荪湿子实体和菌丝体烹熟后的系列在高温中保存2天的时间，有微馊味出现，而加入棘托竹荪子实体提取液和菌丝体提取液的食物中，只有肉类有少许的馊味，其他2种食物没有发现腐败变质。可见棘托竹荪中确有抑菌成分存在，用乙酸乙酯提取后抑菌效果更佳，棘托竹荪干子实体和菌丝体的抑菌效果差不多，为下一步开发利用棘托竹荪菌丝体为天然食品防腐剂奠定一定基础。

3 结论

棘托竹荪的干子实体和菌丝体中均含有抗菌活性物质，用乙酸乙酯提取浓缩后抑菌效果更佳，干子实体和菌丝体的抑菌效果相差不大，而菌丝体可以通过液体发酵培养在短期内大量获得，相对容易和简单，为下一步开发利用棘托竹荪菌丝体为天然食品防腐剂奠定一定基础。