精子CatSper2的表达水平与不同精液参数及妊娠结局关系的初步研究

李伟伟，史鸿志，殷秀荣，闫娅妮，马波

(河北省秦皇岛市妇幼保健院生殖医学科，秦皇岛 066004)

世界范围内已婚孕龄夫妇存在生育困难的发病率高达10%～15%，男女因素大约各占50%[1-2]。辅助生殖技术已经成为治疗不孕不育症的重要手段。目前普遍认为精子功能缺陷是造成男性不育的最主要原因之一。精子特异性钙离子通道(CatSper)共有4个成员CatSper1、CatSper2、CatSper3和CatSper4，CatSper1、CatSper2位于精子尾部，主要对精子鞭毛起作用，在增强精子运动、受能、超活化等方面起作用；CatSper3、CatSper4位于精子头部，主要在顶体反应过程中起作用。CatSper是目前公认的精子细胞上最重要的钙离子通道。近年来有研究表明，CatSper2与男性不育存在相关性[3]，但目前关于CatSper2的研究大多集中在结构和功能方面[4-7]，尚缺少CatSper与辅助生殖技术关系的研究。本文旨在通过研究CatSper2与体外受精(IVF)的受精率、胚胎质量及妊娠结局的关系，从而为改善不育症患者的助孕结局提供一定参考。

资料与方法

一、研究对象及分组

回顾性分析2016年4月至2018年2月于我院生殖中心进行常规IVF治疗的112例夫妻双方的临床资料，纳入标准：女方年龄24～37岁，男方年龄25～40岁；男方无吸烟史、酗酒史、放射线暴露史；夫妻双方染色体均正常；无遗传病家族史，无近期泌尿生殖系统感染；有胚胎形成，均为首次行IVF。

分组情况：(1)取卵日男方取精完毕后，先行精液常规分析，根据精液情况分为两组：精液正常组(46例)：精子浓度>15×106/ml、前向运动精子>32%、正常精子形态>4%；少弱精子组(66例)：精子浓度<15×106/ml、前向运动精子<32%、正常精子形态<4%。各组纳入标准：精液正常组均为女方单纯输卵管性不孕；少弱精子组中女方无其他不孕相关疾病。(2)根据取卵日男方精液的浓度将所有研究对象分为两组：高浓度组(76例)：精子浓度>15×106/ml；低浓度组(36例)：5×106/ml<精子浓度<15×106/ml。(3)根据受精率将所有研究对象分为3组：A组(25例)：受精率<30%；B组(37例)：30%<受精率<60%；C组(50例)：受精率>60%。(4)根据优质胚胎率和可利用胚胎率将所有研究对象分为4组：Q1组(67例)：优质胚胎率>30%；Q2组(45例)：优质胚胎率<30%；Q3组(66例)：可利用胚胎率>50%；Q4组(46例)可利用胚胎率<50%。(5)将104例新鲜周期移植患者根据是否获得临床妊娠分为两组：临床妊娠组42例和未妊娠组56例，另外有6例早期流产患者未纳入分组。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)：纳入研究的患者均采用常规促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长方案COH，达到降调标准后，应用重组人促卵泡激素(Gonal-F，默克雪兰诺，法国)启动促排卵。监测卵泡直径以及子宫内膜的发育情况，Gn和GnRH-a种类及剂量的给予根据卵泡发育的大小和激素水平进行调整。当2～3个主导卵泡直径>18 mm时，停用Gn和GnRH-a；当晚20时注射HCG 5 000～10 000 U，36 h后经阴道超声引导下取卵[8]，所有研究对象的受精方式均采用IVF。

2.精液常规分析：将IVF授精后剩余的精子应用markler精子计数板进行常规分析，项目包括精子的浓度、前向运动精子的百分率以及精子形态学分析等，指标评价参照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第5版[9]标准。所有精液标本的处理由1名规范化培训合格的技术人员操作，充分混匀精液标本，进行3次计数，取平均值。形态学分析采用快速染色方法，参照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第5版进行。

3.精子mRNA提取和逆转录：取卵日，将液化后的精液缓慢加入密度梯度液上层，500g离心15 min后洗涤沉淀，弃上清；沉淀混匀后轻轻加入装有0.5 ml培养液的试管底部置培养箱，倾斜45度上游30 min，待授精。授精后剩余的精子PBS洗涤两次后用于提取mRNA。利用Trizol试剂(Invitrogen，美国)提取总RNA。适量的DEPC水溶解RNA沉淀，-70℃保存备用。取适量总RNA稀释后用分光光度计测定OD260/OD280，比值均在1.8～2.0。计算浓度后备用。逆转录反应：逆转录反应试剂盒购自立陶宛Fermantas公司，操作严格按照说明书进行，产物于-70℃保存待用。

精子纯化：为了确保所检测到的mRNA是成熟精子中的mRNA，上游后的精子经PBS洗涤后，用0.4%伊红Y染色30 min后显微镜下观察。纯化标准：在显微镜下确认无圆形细胞或残余体。

4.聚合酶链式反应(PCR)扩增：引物设计：从Gen Bank查询CatSper2的mRNA基因序列AF411816，引物设计采用Primer 5.0软件完成，序列如表1。应用DNA作为模板，建立25 μl PCR体系：2×Taq酶PCR反应混合液12.5 μl，20 μmol/L引物各1.5 μl，模板DNA 2.0 μl，重蒸馏水 7.5 μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min，降至4℃保温。扩增片段长度为261 bp。凝胶电泳观察结果。用Quantity-one软件分析，以目的基因与内参基因β-actin灰度比值表示目的基因的相对含量。

表1 引物序列

5.观察指标及判断标准：精卵共培养18～20 h后观察双原核(2PN)情况，受精率=2PN数/获卵数。培养第3天(D3)行胚胎评分，根据卵裂球的数量、均匀程度及是否有碎片，按胚胎评分法[10]对D3胚胎进行评分：(1)Ⅰ级胚胎：细胞均匀，形状规则，碎片在0～5%之间；(2)Ⅱ级胚胎：细胞大小均匀，形状略不规则，胞质可有颗粒现象，碎片在5%～10%之间；(3)Ⅲ级胚胎：细胞大小均匀，可有明显的形状不规则，胞质可有颗粒，碎片在10%～25%之间；(4)Ⅳ级胚胎：细胞大多不均匀，胞质可有严重颗粒现象，碎片在25%以上。D3优质胚胎：来源于正常受精卵，受精后D3胚胎细胞数为7～9个，碎片程度小于10%的胚胎；D3优质胚胎率=D3优质胚胎数/正常受精卵裂胚胎数×100%。D3可利用胚胎：受精后D3可移植和冷冻的胚胎总和；D3可利用胚胎率=D3可利用胚胎数/卵裂胚胎数×100%。临床妊娠的判断：D3移植1～2枚可利用胚胎，同时给予黄体支持，移植后14 d检测血清HCG，30 d后B超检查可见孕囊者诊断为临床妊娠；临床妊娠率=临床妊娠数/移植周期数。

三、统计学分析

结 果

一、精子纯化效果

显微镜下观察染色后的精子，并未见圆形细胞或胞质残余体(图1)，证明所检测到的mRNA是成熟精子中的mRNA。

优选后的精子用0.4%伊红Y染色30 min后显微镜下观察，未见圆形细胞和残余体图1 显微镜下精子纯化效果(×400)

二、不同活力精子的CatSper2表达水平比较

精液正常组46例(41.1%)和少弱精子组66例(58.9%)的基础资料比较无显著性差异(P>0.05)。精液正常组和少弱精子组前向运动精子百分率分别为(55.7±8.23)%和(24.9±5.62)%，有显著性差异(P<0.05)；精液正常组的CatSper2表达水平[(1.26±0.23)]显著高于少弱精子组[(0.54±0.18)](P<0.05)。分析发现，前向运动精子百分率和CatSper2基因的相对表达量呈显著性正相关(r=0.416，P<0.05)(图2)。

图2 前向运动精子百分率与CatSper2 mRNA相对表达量的相关性

三、不同浓度精子CatSper2的表达水平比较

高浓度组和低浓度组的基础资料比较无显著性差异(P>0.05)。高浓度组的CatSper2表达水平为(0.89±0.27)，低浓度组为(0.80±0.20)，组间比较无显著性差异(P>0.05)。精子不同浓度与CatSper2表达水平相关性并不显著(r=0.024，P>0.05)。

四、不同受精情况的CatSper2表达水平比较

A、B、C三组间的基础资料比较无显著性差异(P>0.05)。A、B、C三组CatSper2的相对表达量分别为(0.98±0.05)、(1.00±0.06)及(1.01±0.06)，组间比较无显著性差异(P>0.05)(图3)。受精率与CatSper2的相对表达量相关性不显著(r=0.085，P>0.05)(图4)。

图3 不同受精率分组的CatSper2表达水平比较

图4 受精率与CatSper2 mRNA相对表达量的相关性

五、不同胚胎质量CatSper2表达水平比较

Q1、Q2、Q3与Q4组的基础资料比较均无显著性差异(P>0.05)。Q1和Q2组CatSper2的相对表达量分别为(0.93±0.07)和(0.90±0.07)，组间比较无显著性差异(P>0.05)(表2)；优质胚胎率与CatSper2的相对表达量相关性不显著(r=0.096，P>0.05)。Q3和Q4组CatSper2的相对表达量分别为(0.88±0.12)和(0.92±0.11)，组间比较无显著性差异(P>0.05)(表2)；可利用胚胎率与CatSper2的相对表达量相关性亦不显著(r=0.028，P>0.05)。

表2 不同胚胎质量CatSper2的表达水平(-±s)

六、不同妊娠情况的CatSper2表达水平比较

所有研究对象共112个移植周期，其中新鲜移植104个周期(早期流产6个周期)。临床妊娠42例(40.4%，42/104)；未妊娠者56例(53.8%，56/104)。临床妊娠组和未妊娠组的基础资料比较无显著性差异(P>0.05)。临床妊娠组的CatSper2相对表达量为(1.00±0.05)，未妊娠组为(0.98±0.09)，组间比较无显著性差异(P>0.05)。妊娠情况与CatSper2表达水平相关性不明显(r=0.032，P>0.05)。

讨 论

近年来大多研究报道了CatSper1与弱精子症及男性不育的关系[11-13]，CatSper2的研究尚少，且都着重于研究CatSper2在与睾丸及精子中的功能及定位等方面[14]，仅有较少的国外学者曾研究CatSper2的表达水平与男性不育的关系[7]，目前还未有国内的学者研究CatSper2的表达水平与助孕妊娠结局的关系。本实验采用逆转录 PCR的方法检测精液正常组和少弱精子组的CatSper2基因的表达情况，进一步确认CatSper2与男性不育的关系。结果表明少弱精子症患者CatSper2的表达明显低于精液正常组，这个结果与Avidan等[15]2003年发现CatSper2基因缺失导致弱畸精子的研究结果相一致。李红钢等[16]通过检测同一份标本中高、低活力的精子CatSper2和CatSper3的mRNA水平，实验结果表明CatSper2和CatSper3检测可考虑作为男性不育，尤其是弱精子症病因检查的靶点。本实验结果表明不同精子浓度间的CatSper2表达无显著性差异，也进一步证实CatSper2可能是弱精子症的相关靶基因，与Bhilawadikar等[17]的研究相一致。由于弱精子症患者的精子中CatSper2表达下降，我们猜想CatSper2可能与精子的活力相关，这与目前的研究结果相一致。

本研究尝试分析CatSper2与辅助生殖过程中相关指标的相关性，如果CatSper2与受精率、胚胎质量和妊娠有一定的相关性，则其可能作为一项预测IVF结局的危险因素，将CatSper2作为改善IVF不佳结局的一个可能性的靶点。通过进一步研究CatSper2导致精子活力降低的原因，可能通过提高CatSper2在精子中的表达从而改善IVF的不佳结局。遗憾的是，本实验结果表明CatSper2只与活力有相关性，与受精率、胚胎质量和妊娠并无相关性(P>0.05)。一项回顾性的研究表明，与正常精子比较，活力差的精子授精后其辅助生殖助孕的结局不佳[117]。Correia等[18]的研究结果表明，CatSper2在精子超活化等方面发挥重要的作用，但不是一个发育性标志。Quill等[19]研究表明CatSper敲除的精子尾部无“鞭打”运动，基本无前向运动。由此可知，CatSper的作用在于使精子穿透卵母细胞外壳，而对卵母细胞激活和精卵融合无意义。Bhilawadikar等[17]的研究结果与本研究一致，结论为CatSper2与精子活力相关，而与受精率、胚胎质量的相关性不明显。

综上所述，CatSper2与精子活力相关，而与精子浓度、受精率、胚胎质量及妊娠结局的相关性并不明显，提示其对助孕治疗妊娠结局的预测意义不大。但是由于受到研究数量的限制，研究结果可能存在一定偏差。后续需要进一步扩大研究对象，做更深层次的研究，为辅助生殖的不良结局寻找新的解决方案和治疗途径。