生物纳米孔分析技术研究进展

任明伟

摘 要 本文从生物纳米孔的%Z-HL纳米孔、Aerolysin纳米孔、MspA纳米孔、噬菌体phi29连接器的四种分类出发，对生物纳米孔分析技术的应用与发展进行了分析，纳米孔分析技术的发展，特别是近年来在DNA测序得到了广泛应用。

关键词 生物纳米孔 DNA测序

中图分类号：Q819 文献标识码：A

0前言

纳米孔技术作为低成本、高效率的DNA检测技术，研究已经取得了巨大进步。本文着重介绍分子生物学技术的组合，以及纳米孔技术的新进展。

1生物纳米孔的种类

1.1 %Z-HL纳米孔

%Z-HL生物通道蛋白被用于构建了第一个纳米孔，也是目前应用最为广泛的生物纳米孔。%Z-HL是金黄色葡萄球菌分泌的一种多肽毒素，含有293个氨基酸，相对分子质量为3.32？04，可通过自组装形成七聚体的跨膜通道，这一蘑菇状的纳米通道由一个较大的膜外前庭和一个%[-桶状结构的跨膜茎部组成。%Z-HL优异的性质使其成为目前应用最为广泛的生物纳米通道：首先，%Z-HL易于自组装和结构稳定，电导均匀，使得分析物产生的阻断事件可重复；第二，%Z-HL对分析物本质上是非选择性的，确保电流阻断事件是由要测量的各个分子的体积效应引起的。第三，%Z-HL腔对基因突变或化学修饰敏感，以实现特异性检测。

1.2 Aerolysin纳米孔

Aerolysin是一种从嗜水气单胞菌中提取的%[-致孔菌，是一种革兰氏阴性杆菌，与人体腹泻和深部伤口有关。成熟的Aerolysin可以与真核细胞膜表面的糖蛋白受体相互作用。合并并插入细胞膜形成孔，改变膜通透性并最终导致细胞死亡。Aerolysin单体在水溶液中自发形成具有蘑菇形状的七聚体结构，宽约15nm，高约7.0nm，孔径为1.0至1.7nm。其形状和存在广泛用于纳米孔技术的%Z-HL类似，但在顺式末端没有前庭结构。

1.3 MspA纳米孔

MspA是耻垢分枝杆菌耻垢分枝杆菌外膜的主要组分。MspA纳米孔是由相对分子质量为2.0？04的MspA单体蛋白构成的同型八聚体，类似于在最窄点处直径约1.2nm且长度约0.5nm的烟囱。这是一个很好的纳米孔检测传感器。

1.4噬菌体phi29连接器

噬菌体phi29连接器主要由12个gp10亚基组成，形成～7.0nm通道，直径3.6nm，开放端宽6.0nm。在高盐强酸碱环境（pH=2.0-12）下，噬菌体phi29连接器通道仍能保持稳定的通道特性。目前，关于噬菌体phi29连接器研究最多的是一种6-packRNA（pRNA）和ATPase蛋白gp16，它们组装成噬菌体phi29包装马达，作为复杂的纳米孔研究。由于通道的直径较大，可以实现较大的生物分子如dsDNA和高分子量聚合物的检测。

2生物纳米孔分析技术的应用与发展

迄今为止，DNA是纳米孔研究中最常见的聚合物，脂质嵌入的离子通道检测DNA是该研究的突破性实例。最近，固态纳米孔已被用于检测核小体结构和RNA聚合酶的差异，催化DNA转录的关键部分，为理解染色体结构和转录研究创造了新的机会。一些蛋白质在运输过程中“减压”，运输过程可用于测量减压动力学。已经研究了许多这些蛋白质的减压行为，并且纳米孔可以被动态地用作不需要标记的高效力光谱仪。为了研究大脑对药物的化学反应，重要的神经递质也被动态地实时区分开来。与其检测技术相比，纳米孔更有前途，效率高，速度快，价格低廉，且具有良好的准确性和检测性能。

2.1大型固态纳米孔可以用来动态地捕获释放的细菌

为动态捕获单个单元提供更快，更便宜的方法。使用脂肽涂覆的固态纳米孔，可以检测到DNA与相邻孔隙膜的相互作用。热反应性聚合物的发展促进了智能纳米孔的发展。智能纳米孔可以用作动态响应温度的装置，由电解质刷组成的生物纳米孔可以控制孔附近的盐电导。

纳米孔的DNA测序也已取得进展。最近的分子动力学研究表明，使用DNA聚合酶作为棘轮，通过控制DNA单链在石墨烯纳米孔上的转运可以获得核苷酸序列的高精度读数。在溶血素中使用链霉抗生物素蛋白可以选择性地固定DNA链，这可以高分辨率地区分孔上不同几何位置的核酸。P-n半导体结降低了DNA易位速率，可以在位移过程中动态控制电压。采用新型基于CMSO的放大器，可以实现亚微秒级的电流检测。关于DNA测序的理论研究，已经提出了可行的建议和方法来解决上述对离子电流测量速度的限制。模拟显示石墨烯碳纳米带上的纳米孔可以使用孔边缘处的电流密度，导致更高的分辨率。也已经提出了垂直于纳米通道放置的石墨烯碳纳米带的电导变化作为DNA碱基易位测序装置。

2.2有机小分子检测

生物纳米孔在直接检测小有机分子方面有一些困难。如果分子适配器可以引入到纳米孔中，则適配器和分析物之间的特定相互作用可以用于检测小的有机分子。适配器通常是一个圆形分子，它在纳米孔内以非共价方式连接到孔壁，并充当纳米孔和小分子之间相互作用的介质。

3结束语

生物纳米孔分析技术已广泛应用于DNA测序、蛋白质结构研究及单分子检测等领域，且应用领域正在不断拓宽。然而，作为一种新颖的单分子分析手段，纳米孔技术在实际样品检测、数据处理和检测装置等方面也存在着诸多挑战。

参考文献

[1] Kasianowicz，J.J.&E.Brandin;&D.Branton;，etal.CharacterizationofIndividualPolynucleotideMoleculesUsingaChannel[J].ProcNatlAcadSciUSA，2016，93（24）：13770-13773.