3种方法提取沙枣黄酮工艺的优化研究

王 楠，刘战霞，程卫东

(石河子大学食品学院，新疆石河子 832000)

沙枣(ElaeagnusangustifoliaL.)是一种药食两用的植物资源，其具有耐盐碱、繁殖能力强、药用价值高等自然优势特点，且在新疆随处可见。沙枣中具有多种活性成分，经济价值较高。沙枣果实含糖量43%～59%，果糖约有20%，但研究表明沙枣中不含蔗糖和乳糖[1]。另外，含蛋白质8%，有机酸3%，果胶1%，果实中还含有黄酮类、核黄素、胡萝卜素及17种氨基酸[2-5]。但是目前沙枣只有小部分在民间作为药材、直接食用或进行简单的初步加工，还有一些是动物自由采食，绝大多数成熟后腐烂废弃，利用率很低，导致沙枣这种植物资源极大地浪费。目前国外报道关于沙枣的研究多为对其种植方式以及保健功能和药理活性方面，包括抗氧化作用、抑菌效果、调节免疫力、抗炎止痛作用等。沙枣黄酮类物质能够显著清除机体氧自由基，这种抗氧化的能力是VE的数十倍，该抗氧化效果能阻碍细胞的衰老，遏制癌细胞的生长。Cansev等[6]通过对沙枣果皮提取物的抗氧化作用的研究，发现黄酮对·OH有显著的清除效果。Erhart等[7]经过大量研究得出，黄酮类化合物抗肿瘤效果的靶点很多，能刺激癌细胞衰亡。有研究表明，黄酮类化合物可减少胆固醇含量，缩小心脑血管疾病的发生率，所以针对由糖尿病引起的视网膜病及毛细血管脆化有良好的效果；加速伤口愈合和止痛，可以用于各类敏感症状[8-11]。Ahmadiani等[12]通过观察老鼠的慢性和急性疼痛，发现了沙枣果水提物的镇痛作用。近年来，人们对沙枣中活性物质的开发、应用主要着眼于沙枣多糖，对于沙枣黄酮类化合物的研究相对较少。结合新疆当地的沙枣资源优势，以沙枣为原料，沙枣黄酮为目标提取物，通过单因素和响应面试验分析对比3种提取沙枣黄酮的方法，以获得提取沙枣黄酮的最优工艺条件。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1原料与试剂。原料：沙枣，购自石河子市农贸市场，手工去核，冷冻干燥，粉碎过筛后保存备用。试剂：芦丁对照品，标准品；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

1.1.2仪器与设备。HD-500粉碎机，海道机械有限公司；Neofuge15R高速冷冻离心机，大康发展有限公司；BS2000S电子天平(d=0.1 mg)，北京赛多利斯天平有限公司；UV-9200紫外分光光度计，北京瑞利；KQ-200VDE超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；ZXRD-7080美的微波炉，上海智城分析仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂。

1.2方法

1.2.1标准曲线的绘制。采用硝酸铝显色法[13]，以芦丁作为标准品，根据芦丁标准曲线可得到沙枣黄酮的浓度[14]。

1.2.2供试品溶液的制备。取沙枣干粉10 g至250 mL烧杯中，加入浓度为 60% 乙醇100 mL 浸泡30 min，调节超声温度为60 ℃，超声提取30 min后，离心取上清液为沙枣黄酮提取物供试品溶液。

1.2.3黄酮含量计算。计算公式如下：

黄酮含量(mg/g)=a×c×V/W

式中，a为稀释倍数，c为黄酮浓度，V为提取液体积，W为沙枣粉质量。

1.2.4传统溶剂提取法。采用单因素试验考察料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g∶mL)]、提取温度(40、50、60、70 ℃)和乙醇浓度(50%、60%、70%、80%)对沙枣黄酮提取含量的影响。称取沙枣粉2.00 g 4份，加入乙醇后浸泡30 min，水浴加热提取，离心20 min，取1 mL上清液加入硝酸铝显色体系并定容于25 mL容量瓶中，20 min后测吸光度，计算黄酮含量。

根据单因素试验结果，利用Design Expert 8.0软件中的二次旋转中心组合设计(central composite design，CCD)进行试验设计，选取料液比(A)，提取温度(B)，乙醇浓度(C)共3个因素，以单因素最佳条件确定因素水平，以沙枣黄酮含量为响应值，设计20组试验，14个析因点，6个中心点，进行试验设计分析，并找出最佳工艺参数。因素与水平设计见表1。

表1传统溶剂提取法和超声波辅助提取法CCD试验因素水平设计

Table1FactorandLeveldesignofCCDtestfortraditionalsolventextractionandultrasonicassistedextraction

水平Level因素Factor料液比(A)Solid-liquid ratio(g∶mL)提取温度(B)Extraction temperature∥℃乙醇浓度(C)Ethanol concentration∥%-1.681∶6.5943.1853.18-11∶1050.0060.0001∶1560.0070.0011∶2070.0080.001.681∶23.4176.8286.32

1.2.5超声波辅助提取法。采用单因素试验考察料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g∶mL)]、超声温度(40、50、60、70 ℃)和乙醇浓度(50%、60%、70%、80%)对沙枣黄酮提取含量的影响。称取沙枣粉2.00 g 4份，加入乙醇后浸泡30 min，超声提取，离心20 min，取1 mL上清液加入硝酸铝显色体系并定容于25 mL容量瓶中，20 min后测吸光度，计算黄酮含量。

根据单因素试验结果，利用Design Expert 8.0软件中的二次旋转中心组合设计进行试验设计，因素与水平设计同表1。

1.2.6微波辅助提取法。采用单因素试验考察料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g∶mL)]、提取时间(3、5、10、15 min)和乙醇浓度(50%、60%、70%、80%)对沙枣黄酮提取含量的影响。称取沙枣粉2.00 g 4份，加入乙醇后浸泡30 min，微波提取，离心20 min，取1 mL上清液加入硝酸铝显色体系并定容于25 mL容量瓶中，20 min后测吸光度，计算黄酮含量。

根据单因素试验结果，利用Design Expert 8.0软件中的二次旋转中心组合设计进行试验设计，因素与水平见表2。

表2微波辅助提取法CCD试验因素水平设计

Table2FactorandLeveldesignofCCDtestwithmicrowave-assistedextraction

水平Level因素Factor料液比(A)Solid-liquid ratio(g∶mL)提取时间(B)Extraction timemin乙醇浓度(C)Ethanol concentration∥%-1.681∶6.591.5953.18-11∶105.0060.0001∶1510.0070.0011∶2015.0080.001.681∶23.4118.4186.32

1.2.73种提取方法的比较。 分别对比传统溶剂提取法、超声波辅助提取法和微波辅助提取法在最佳工艺条件下提取沙枣黄酮的含量，确定沙枣黄酮的最佳提取方法。

2 结果与分析

2.1标准曲线的绘制芦丁标准品浓度与吸光度的关系，得到线性回归方程为y=0.157 3x-0.134 9，R2=0.999 5。其中y为吸光度值，x为浓度(mg/mL)。结果表明，芦丁标准品溶液在此范围内，线性良好，符合比尔定律。

2.2传统溶剂提取法

2.2.1单因素试验。

2.2.1.1料液比对沙枣黄酮提取效果的影响。由图1可知，料液比为1∶15(g∶mL)时，黄酮提取含量达到峰值。在一定的范围内，料液比中溶剂量增加，有利于系统浓度差增加，利于黄酮类化合物的溶出；料液比中溶剂量过高，会沉淀出一些醇溶性杂质，并且会造成浪费。因此确定1∶15(g∶mL)为最佳料液比。

图1 料液比对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.2.1.2提取温度对沙枣黄酮提取效果的影响。由图2可知，提取温度60 ℃时，黄酮提取含量达到峰值。随着温度的升高，分子运动速度加快，分子扩散和渗透作用增强，使得细胞内的成分更容易溶出，但温度过高情况下，黄酮类化合物的结构可能会遭到破坏。因此选择60 ℃作为沙枣黄酮的提取温度。

图2 提取温度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.2 Effects of extraction temperature to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.2.1.3乙醇浓度对沙枣黄酮提取效果的影响。由图3可知，在乙醇浓度70%时，提取含量达到峰值。当乙醇浓度为70%时，与沙枣中黄酮类化合物的极性相近，根据“相似相溶”原理，此时沙枣黄酮在其中的溶解度最大，更有利于溶出，因此选择提取黄酮的乙醇浓度为70%。

图3 乙醇浓度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.2.2响应面试验。

2.2.2.1CCD试验及结果分析。通过回归系数分析得到传统溶剂提取沙枣黄酮的回归方程如下：含量(mg/g)=9.34+0.25A+0.085B-0.14C-0.18AB-0.40AC-0.20BC-0.59A2-0.78B2-0.79C2。

方差分析显示，F模型=25.759 48，P模型=<0.000 1**；FA=9.216 097，PA=0.012 6*；FB=1.023 556，PB=0.335 5；FC=2.840 605，PC=0.122 8；FAB=2.737 946，PAB=0.129 0；FAC=13.204，PAC=0.004 6**；FBC=3.375 502，FBC=0.096 0；FA2=52.395 52，PA2<0.000 1**；FB2=91.215 23，PB2<0.000 1**；FC2=94.170 72，PC2<0.000 1**；F失拟合=1.217 677，P失拟合=0.417 1。回归模型方差分析表明，模型变量与3个自变量之间的线性关系极显著，有统计学意义，可以进行沙枣黄酮的预测和分析。试验因素对沙枣黄酮含量的影响不仅存在线性关系，二次方关系很明显，同时存在交互作用。对沙枣黄酮含量影响由高到低是料液比、乙醇浓度、提取温度。

2.2.2.2响应曲面图及分析。由图4表明，A因素和B因素不存在交互作用。随着料液比的增加，沙枣黄酮含量在快速增加，但超过一定值时，沙枣黄酮含量出现下降。随着提取温度的增加沙枣黄酮含量在缓慢增加，但超过一定值时，沙枣黄酮含量出现下降，表明料液比对沙枣黄酮含量的影响高于提取温度。

图4 料液比和温度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.4 Effects of solid-liquid ratio and extraction temperature of Elaeagnus angustifolia flavonoids

由图5表明，A因素和C因素存在交互作用，即A因素对沙枣黄酮含量的影响与C因素有关，C因素对沙枣黄酮含量的影响与A因素有关。随着料液比的增加，沙枣黄酮含量在快速增加，但超过一定值时，沙枣黄酮含量出现下降。随着乙醇浓度的增加沙枣黄酮含量在缓慢增加，但超过一定值时，沙枣黄酮含量出现下降，表明料液比对沙枣黄酮含量的影响高于乙醇浓度。

图5 料液比和乙醇浓度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.5 Effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration of Elaeagnus angustifolia flavonoids

由图6表明，B因素和C因素不存在交互作用。随着乙醇浓度的增加，沙枣黄酮含量在缓慢增加，但超过一定值时，沙枣黄酮含量出现缓慢下降。随着提取温度的增加沙枣黄酮含量在增加，但超过一定值时，沙枣黄酮含量出现下降，表明提取温度和乙醇浓度对沙枣黄酮含量的影响差异不明显。

图6 乙醇浓度和温度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.6 Effects of ethanol concentration and extraction temperature to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.2.3验证试验。由曲面图结合回归方程得出传统溶剂法提取沙枣黄酮的最佳工艺参数为提取温度60.44 ℃，料液比1∶16.31 (g∶mL)，乙醇浓度为68.41%，在此条件下黄酮提取含量达到最高，理论预测值为9.386 mg/g。为检验响应面试验的可靠性，采用上述最优条件进行验证试验，同时考虑到操作的方便性，将提取工艺参数修正为提取温度60 ℃，料液比为1∶15(g∶mL)，乙醇浓度为70%，在此条件下，对沙枣黄酮进行3次提取，平均提取含量达到8.976 mg/g，与预测值接近，说明该模型能较好地分析和预测沙枣黄酮的提取工艺参数，试验方法可靠。

2.3超声波辅助提取法

2.3.1单因素试验。由图7可知，选取1∶15(g∶mL)为提取沙枣黄酮的最佳料液比。由图8可知，选择60 ℃作为沙枣黄酮的提取温度。由图9可知，选择提取黄酮的乙醇浓度为70%。

图7 料液比对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.7 Effects of solid-liquid ratio to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

图8 提取温度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.8 Effects of extraction temperature to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

图9 乙醇浓度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.9 Effects of ethanol concentration to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.3.2响应面试验。

2.3.2.1CCD试验及结果分析。通过回归系数分析得到超声波辅助提取沙枣黄酮的回归方程如下：含量=11.29+0.054A+0.28B+0.039C+0.33AB-0.25AC+0.18BC-0.44A2-0.81B2-0.67C2。

方差分析显示，F模型=12.674，P模型=0.000 2**；FA=0.243 56，PA=0.632 3；FB=6.496 95，PB=0.028 9*；FC=0.128 77，PC=0.727 2；FAB=5.308 95，PAB=0.043 9*；FAC=3.013 85，PAC=0.113 2；FBC=1.614 08，PBC=0.232 7；FA2=17.066 7，PA2=0.002 0**；FB2=57.400 1，PB2<0.000 1**；FC2=40.098 8，PC2<0.000 1**；F失拟合=2.193 39,P失拟合=0.204 5。回归模型方差分析表明，说明模型变量与3个自变量之间的线性关系极显著，有统计学意义。试验因素对沙枣黄酮含量的影响不仅存在线性关系，二次方关系很明显，同时存在交互作用。对沙枣黄酮含量影响由高到低是提取温度、料液比、乙醇浓度。

2.3.2.2响应曲面图及分析。由图10可知，A因素和B因素存在交互作用。提取温度对沙枣黄酮含量的影响高于料液比。由图11可知，A因素和C因素存在交互作用。料液比和乙醇浓度对沙枣黄酮含量的影响差异不明显。由图12可知，B因素和C因素不存在交互作用。提取温度对沙枣黄酮含量的影响高于乙醇浓度。

图10 料液比和温度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.10 Effects of solid-liquid ratio and extraction temperature of Elaeagnus angustifolia flavonoids

图11 料液比和乙醇浓度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.11 Effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration of Elaeagnus angustifolia flavonoids

图12 乙醇浓度和温度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.12 Effects of ethanol concentration and extraction temperature to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.3.3验证试验。由曲面图结合回归方程得出超声波辅助法提取沙枣黄酮的最佳工艺参数为温度为62.02 ℃，料液比1∶15.65(g∶mL)，乙醇浓度70.32%，在此条件下黄酮提取含量达到最高，理论预测值为11.328 mg/g。为检验响应面试验的可靠性，采用上述最优条件进行验证试验，同时考虑到操作的方便性，将提取工艺参数修正为提取温度60 ℃，料液比1∶15(g∶mL)，乙醇浓度70%，在此条件下，对沙枣黄酮进行3次提取，平均提取含量达到11.163 mg/g，与预测值接近，说明该模型能较好地分析和预测沙枣黄酮的提取工艺参数，试验方法可靠。

2.4微波辅助提取法

2.4.1单因素试验。

2.4.1.1料液比对沙枣黄酮提取效果的影响。由图13可知，选取1∶15(g∶mL)为提取沙枣黄酮的最佳料液比。

图13 料液比对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.13 Effects of solid-liquid ratio to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.4.1.2提取时间对沙枣黄酮提取效果的影响。由图14可知，浸提时间为10 min时，提取含量达到峰值。因为微波时间太短时，沙枣黄酮不能完全溶解到溶液中；而当时间过长时，高温破坏了沙枣黄酮成分，引起黄酮类物质分解。因此确定10 min为沙枣黄酮的最佳提取时间。

图14 提取时间对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.14 Effects of extraction time to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.4.1.3乙醇浓度对沙枣黄酮提取效果的影响。由图15可知，选择提取黄酮的乙醇浓度为70%。

图15 乙醇浓度对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.15 Effects of ethanol concentration to extract content of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.4.2响应面试验。

2.4.2.1CCD试验及结果分析。通过回归系数分析得到超声波辅助提取沙枣黄酮的回归方程如下：含量=9.95+0.30A+0.001 862B-0.13C+0.14AB-0.30AC-0.058BC-0.80A2-0.067B2-0.84C2。

方差分析可知，F模型=20.847 2，P模型<0.000 1**；FA=9.756 6，PA=0.010 8*；FB=0.000 3，PB=0.985 0；FC=1.743 0，PC=0.216 2；FAB=1.249 6，PAB=0.289 8；FAC=5.688 9，PAC=0.038 3*;FBC=0.212 7，PBC=0.654 6；FA2=72.123 0，PA2<0.000 1**；FB2=50.115 6，PB2<0.000 1**；FC2=79.674 5，PC2<0.000 1**；F失拟合=0.836 9，P失拟合=0.575 1。回归模型方差分析说明模型变量与3个自变量之间的线性关系极显著，有统计学意义，试验因素对沙枣黄酮含量的影响不仅存在线性关系，二次方关系很明显，同时存在交互作用。对沙枣黄酮含量影响由高到低是料液比、乙醇浓度、提取温度。

2.4.2.2响应曲面图及分析。由图16可见，A因素和B因素不存在交互作用。料液比对沙枣黄酮含量的影响高于提取时间。由图17可见，A因素和C因素存在交互作用，料液比对沙枣黄酮含量的影响高于乙醇浓度。由图18可见，B因素和C因素不存在交互作用。提取时间对沙枣黄酮含量的影响高于乙醇浓度。

图16 料液比和时间对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.16 Effects of solid-liquid ratio and extraction time of Elaeagnus angustifolia flavonoids

图17 料液比和乙醇浓度对提取含量的影响Fig.17 Effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration of Elaeagnus angustifolia flavonoids

图18 乙醇浓度和时间对沙枣黄酮提取含量的影响Fig.8 Effects of ethanol concentration and extraction time of Elaeagnus angustifolia flavonoids

2.4.3验证试验。由曲面图和等高线图，再结合回归方程得出超声波辅助法提取沙枣黄酮的最佳工艺参数为提取时间10.14 min，料液比1∶16.07(g∶mL)，乙醇浓度为68.85%，在此条件下黄酮提取含量达到最高，理论预测值为9.992 mg/g。为检验响应面试验的可靠性，采用上述最优条件进行验证试验，同时考虑到操作的方便性，将提取工艺参数修正为提取时间10 min，料液比为1∶15(g∶mL)，乙醇浓度为70%，在此条件下，对沙枣黄酮进行3次提取，平均提取含量达到10.113 mg/g，与预测值接近，说明该模型能较好地分析和预测沙枣黄酮的提取工艺参数，试验方法可靠。

2.53种提取方法的比较传统溶剂提取法得到沙枣黄酮提取含量8.976 mg/g，超声波辅助提取法得到沙枣黄酮提取含量11.163 mg/g，微波辅助提取法得到沙枣黄酮提取含量10.113 mg/g。因此超声波辅助提取法效果最佳，微波辅助提取法次之，传统溶剂提取法提取黄酮含量最低。因此选用超声波辅助提取法。

3 结论

以新疆沙枣为原料，比较传统溶剂提取法、超声波辅助提取法和微波辅助提取法对沙枣黄酮提取效果的影响。通过单因素试验，考察料液比、提取时间、提取温度和乙醇浓度的影响。利用Design Expert 8.0软件中的二次旋转中心组合设计(central composite design，CCD)进行试验设计。对比得到超声波辅助提取法的效果优于其他2种方法，因此选用该方法进行沙枣黄酮的提取，为后续的沙枣黄酮纯化及应用试验提供可靠依据，其最佳工艺条件为提取温度为62.02 ℃，料液比1∶15.65(g∶mL)，乙醇浓度70.32%，此条件下沙枣黄酮含量达最高，理论预测值为11.320 mg/g。验证试验得出，提取温度60 ℃，料液比为1∶15(g∶mL)，乙醇浓度为70%，提取含量达到11.163 mg/g。