绿豆发芽过程中SOD和蛋白质的变化规律研究

符丽雪 ， 钱丽丽 ，2

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室，黑龙江大庆 163319）

绿豆不仅包含人体所需的基本营养物质，还拥有许多生物活性物质，如黄酮类化合物、多酚类、多糖、蛋白质水解酶、苯丙氨酸氨解酶、抗性淀粉、香豆素、生物碱等[1]。这些成分都具有一定的生理功能，如改善肠道菌群组成、降血脂血糖、抗氧化、提高免疫力、清热解毒等[2]。并且相关研究[3]表明，绿豆发芽时，伴随酶活性的启动，其活性成分及营养物质发生部分改变，从20世纪60年代初至今，人们积极从绿豆及其萌芽中找寻生物活性物质，并对其进行分离提纯及定性定量的研究。目前对于绿豆中活性成分的研究主要集中在黄酮类化合物，国内对于杂粮中SOD性质的研究多数集中在水稻、玉米、大豆等作物中，但在绿豆作物中有关SOD的研究较少，试验以绿豆为原料，研究绿豆在发芽3～7 d内的SOD活性变化规律，采用NBT光还原法[4]测定绿豆发芽不同时期及不同部位的SOD活性，参考考马斯亮蓝G-250法检测蛋白质含量。对绿豆发芽时间、发芽部位SOD活性进行差异性显著分析。

1 试验材料和仪器

1.1 试验材料

绿豆（市售）。

1.2 试验仪器

FA2004B型电子天平，上海菁海仪器有限公司产品；DHP600型恒温培养箱，上海鹏顺科学仪器有限公司产品；2-16p型离心机，德国CGM产品;Intergral5型默克纯水仪，默克化工技术有限公司产品；HYQ-212A型快速混匀器，深圳市瑞鑫达仪器有限公司产品；WisetisHG-15D型数码分散机，广州泰通仪器有限公司产品；澳柯玛冰箱，澳柯玛股份有限公司产品。

1.3 试验主要试剂

核黄素，分析纯，合肥博美生物科技有限责任公司提供；氯化硝基四氮唑蓝（NBT），高纯级，合肥博美生物科技有限责任公司提供；考马斯亮蓝R250，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司提供。

2 试验方法

2.1 绿豆发芽工艺流程

称取绿豆→挑选绿豆→纯水清洗→恒温浸泡→种子露白→移栽培养→绿豆芽。

2.2 操作要点

①称取500 g的绿豆；②挑选绿豆，挑选颗粒饱满、无虫害及霉变的绿豆；③纯水清洗，使用默克纯水仪生产的超纯水清洗绿豆表面；④每100 g绿豆中加入500 mL超纯水，放在烧杯中浸泡24 h；⑤待种子露白后将绿豆取出放置在铺有3层纱布的长方形瓷盘中继续培养，使用小喷瓶每天浇水2次，浇水至浸没纱布为止，在24℃恒温培养箱中进行培养，并及时将不同天数的绿豆进行分离处理。

2.3 绿豆发芽过程中SOD和蛋白质的变化规律

采集发芽不同时间（3～7d）的绿豆及不同部位样品作为研究对象，研究绿豆芽发芽过程中SOD和蛋白质的变化规律。

2.3.1 SOD的变化规律研究

取整根绿豆、根（胚根）、茎（下胚轴）、胚（胚芽）于50℃烘箱中烘24 h至干，将烘干后的样品粉碎后，放入中号塑料袋或塑料瓶中备用；称取绿豆芽样品粉末5 g，加入磷酸缓冲液（PBS） 25 mL，搅拌均匀后，在4℃条件下，以转速10 000 r/min离心20 min，取得的上清液为SOD酶粗提液。

SOD活性测定试剂见表1。

表1 SOD活性测定试剂

按表1加好试剂，在4 000 lx荧光灯下进行照光，时间控制在20 min，（主要目的是各管照光情况相同，把控反应温度在25～35℃，反应时间根据酶活性高低而定)，最后于波长560 nm处测定各反应液的吸光度。以缓冲液替代酶液做空白对照。

2.3.2 蛋白质的变化规律研究

采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量。

2.4 试验结果计算

以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD酶活性。

式中：ACK——照光对照管的吸光度；

AE——样品管的吸光度；

V——样液总体积，mL；

Q——样品质量，g；

VT——测定时样品的用量，mL；

2.5 数据处理方法

试验数据处理采用SPSS 19.0版本的单因素方差分析方法，多重比较采用Duncan法。图形处理为Microsoft Excel（Office 2007） 软件。

3 结果与分析

3.1 不同发芽时间SOD酶及蛋白质含量的变化规律

以发芽时间在3～7 d内的整根绿豆为样品进行酶活和蛋白质的测定。

绿豆发芽时间对SOD及蛋白含量的影响见表2。

表2 绿豆发芽时间对SOD及蛋白含量的影响

由表2可知，由于发芽时间不同，SOD活力和蛋白质含量均存在显著性差异。SOD活力最高为3 079 U/mL，蛋白含量最高为4.49 mg/mL。随着发芽时间的延长，酶活力不断攀升，第3天到第5天的增幅达21.9%；在第5天达到顶峰，随后开始缓慢降低，降幅相比增幅小；而第5天到第7天的降幅仅为8%；绿豆发芽3～7 d过程中，蛋白质含量不断上升，绿豆通过叶的光合作用不断合成新的蛋白质。依据绿豆发芽3～7 d的酶活力和蛋白含量，计算SOD比活力。绿豆发芽第5天时，比活力最大。发芽3～5 d的情况下，SOD的比活力存在显著性差异。

3.2 研究不同部位SOD及蛋白质含量的变化规律

3.2.1 绿豆茎的酶活及蛋白含量测定

以发芽时间在3～7 d内的绿豆茎为样品进行酶活和蛋白质的测定。

绿豆茎的酶活及蛋白含量见表3。

由表3可知，发芽3～5 d时，绿豆茎中SOD活力差异显著，SOD活力最高为1 311 U/mL，蛋白含量最高为4.79 mg/mL；发芽时间在4～6 d时，SOD的比活力差异不显著。

表3 绿豆茎的酶活及蛋白含量

3.2.2 绿豆胚的酶活及蛋白含量测定

以发芽时间在3～7 d内的绿豆胚为样品进行酶活和蛋白质的测定。

绿豆胚的酶活及蛋白含量见表4。

表4 绿豆胚的酶活及蛋白含量

由表4可知，SOD活力最高为2 458 U/mL，蛋白含量最高为5.15 mg/mL。发芽3～5 d时，绿豆胚的SOD的比活力差异显著，伴随发芽时间的增长，SOD的比活力也逐渐增加，当发芽时间超过5 d后，SOD的比活力反而减小。

3.2.3 绿豆根的酶活及蛋白含量测定

以发芽时间在3～7 d内的绿豆根为样品进行酶活和蛋白质的测定。

绿豆根的酶活及蛋白含量见表5。

由表5可知，SOD活力最高为5956 U/mL，蛋白含量最高为4.27 mg/mL，除发芽第5天SOD的比活力外，发芽3～7 d内的SOD的比活力差异不显著。

绿豆中的SOD主要集中在绿豆的根部，绿豆不同部位随发芽时间的变化与绿豆芽整体类似，均呈现先上升后下降的趋势，绿豆生长过程中，SOD比活力大小的顺序为根＞胚＞茎。绿豆根的活性最高，其SOD的比活力分别为胚、茎的3倍和5倍。

表5 绿豆根的酶活及蛋白含量

4 结论

以绿豆为原料，在发芽3～7 d的条件下，制备绿豆SOD粗酶液，研究SOD活性和蛋白质含量的变化规律。通过试验发现，绿豆SOD比活力在发芽过程中呈钟形曲线，比活力在发芽初期随时间延长而增大，发芽至第5天时，SOD的比活力最强，为783 U/mg，随后开始出现下降趋势。绿豆发芽过程中不同部位间SOD比活力存在显著性差异。绿豆发芽时根部SOD的比活力最强，为1 649 U/mg。蛋白质含量与发芽时间成正比，随发芽时间的增长而增大。