黄角颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠JAK2/STAT3信号通路的影响*

潘宋斌， 万 琳， 邵 卫， 唐 坤， 姚汉云

(1武汉市第一医院神经内科， 湖北 武汉 430022; 2武汉市中医医院内分泌科， 湖北 武汉 430014)

脑缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，IRI)是指脑部血供中断后，重新开通闭塞血管及恢复大脑血供后造成的脑组织损伤，其对人类的危害仅次于肿瘤和心脏疾病，是人类致死和致残的重要原因之一[1-2]。研究发现IRI发病机制可能为脑血供受阻中断后，引起脑组织细胞发生缺氧缺血，而恢复大脑血供后可进一步诱发炎症级联反应、氧自由基产生增多及细胞凋亡，因此有效抑制炎症反应、减少氧化应激和细胞凋亡是减轻脑IRI的有效途径[3]。Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator transcription 3，JAK2/STAT3)信号通路是一条重要的炎症反应相关通路，在脑IRI的发病机制中具有重要作用[4-5]。黄角颗粒由大黄和水牛角2味中药组成，具有通腑泄热和凉血解毒的功效，已有研究证实其对于脑梗死的治疗作用显著[6-7]。本研究构建大鼠脑缺血再灌注损伤模型，探讨黄角颗粒对脑缺血再灌注损伤的作用及其潜在机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠共30只，体重(230±20) g， 8～9周龄，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号为SCXK(鄂)2015-0018，给予标准饲料在12 h明暗交替环境下适应性喂养1周，自由饮水。

2 主要试剂与仪器

黄角颗粒由武汉市第一医院制剂科提供，大黄和水牛角破壁粉剂按1∶2比例配制，用蒸馏水稀释为100%溶液备用(即含生药1 kg/L)。兔抗人p-JAK2多克隆抗体(货号ab195055；稀释比1∶1 000)、兔抗人p-STAT3单克隆抗体(货号ab76315；稀释比1∶200 000)、兔抗人β-actin多克隆抗体(货号ab8227；稀释比1∶2 000)和山羊抗兔II抗(货号ab6721；稀释比1∶2 000)均购自Abcam；TUNEL检测试剂盒购于武汉博士德公司； 氯化2，3，5-三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)购自Sigma。

高速离心机购自Eppendorf；电泳仪购自Bio-Rad；石蜡包埋机和石蜡连续切片机购自德国徕卡公司；摊片烤片机购自湖北康强医疗器械有限公司；光学显微镜及显微镜成相分析系统购自Olympus。

3 方法

3.1动物模型的构建 参考Zea Longa的方法建立大鼠左侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型[8-9],具体方法如下：大鼠术前禁食24 h，自由饮水，大鼠称重，用10%水合氯醛以3.5 mL/kg进行腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，术区备皮进行常规消毒，取颈部正中纵切口，长约2 cm，依次暴露颌下腺、胸锁乳突肌和肩胛舌骨肌，分别用自制小拉钩拉向两旁进行固定，选取左侧大脑中动脉作为缺血侧，右侧为正常对照。分离左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)及其分支甲状腺上动脉和枕动脉、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)及其分支翼腭动脉(pterygopalatine artery，PPA)，结扎ECA及其分支甲状腺上动脉和枕动脉，随后用显微动脉夹分别夹住ICA和CCA，用显微手术剪刀在ECA断端距动脉分叉3 mm处的动脉壁上侧切小口，将尼龙鱼线插入，调整线栓走向使其与ICA近一直线，移去ICA的显微动脉夹，线栓至ICA颅内段时缓慢推进，遇轻微阻力即停止推进，此时线栓插入深度约20 mm(从CCA分叉处计算，若误入翼腭动脉中线栓插入15 mm长度即有阻力，不能继续插入)，即可阻断大脑中动脉，引起左侧MCAO。然后扎紧ECA，观察无出血后缝合皮肤。缺血2 h后再灌注，将尼龙鱼线抽出，使其头端退回到ECA主干内，恢复左侧大脑中动脉供血。将麻醉苏醒后的大鼠放回鼠笼进行单笼饲养，让其自由饮食。假手术组除不插鱼线闭塞大脑中动脉之外，其余步骤同造模组。术中需保持室内温度为25 ℃。

3.2实验分组 将大鼠分为假手术(sham operation)组、脑缺血再灌注模型(model)组和黄角颗粒(Huangjiao granule)组，每组10只。假手术组大鼠仅切开颈部皮肤，暴露左侧颈总动脉；脑缺血再灌注模型组大鼠在缺血再灌注前30 min给予10 mL/kg的生理盐水进行腹腔注射；黄角颗粒组大鼠在缺血再灌注前30 min给予10 mL/kg的黄角颗粒溶液(生药含量1 kg/L)进行腹腔注射。

3.3神经功能评分 各组大鼠缺血再灌注24 h后观察其神经系统症状，主要观察大鼠肢体瘫痪和转圈等情况，并作提尾悬空试验，剔除有痉挛和意识障碍的大鼠。参考经典的MACO模型神经功能评分(Zea Longa评分法)标准[9]：无神经损伤症状为0 分；不能完全伸展对侧前爪为1分；向对侧转圈为2分；向对侧倾斜为3分;不能自发行走，意识丧失为4分。

3.4TTC染色观察大鼠脑梗死百分比 各组大鼠缺血再灌注24 h后，于冰上快速断头处死，取出其脑组织于-80 ℃冰箱中冷冻3～5 min后，自额极向后冠状面切成2 mm厚的切片。将切片浸泡在1% TTC溶液中，严格避光条件下37 ℃恒温孵育约30 min，每隔5 min翻动一次脑组织切片，染色成功后，正常脑组织为红色，梗死脑组织为白色。将染色成功的脑切片移至黑色纸板上，按由前至后的顺序排列，用数码相机拍照，输入计算机，图像经过专业图像分析软件IPP 6.0处理并分析，计算大鼠脑梗死体积百分比，计算公式为：脑梗死体积百分比(%)=脑梗死体积/(脑梗死体积+脑非梗死体积)×100%。

3.5HE染色 各组大鼠缺血再灌注24 h后，于冰上快速断头处死，在冰盘上取出脑组织，用10%甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋，制成石蜡切片。冠状切片，片厚4 μm，进行HE染色。

3.6TUNEL法检测各组大鼠脑细胞凋亡 将制好的石蜡切片进行TUNEL染色检测各组大鼠脑细胞凋亡，方法步骤按照TUNEL检测试剂盒说明书进行。每张病理切片随机选取不交叉重复的5个视野在光学显微镜下进行观察，呈现棕黄色的细胞为凋亡细胞，取5个视野的凋亡细胞平均值作为该样本的凋亡细胞数。脑细胞凋亡率(%)=凋亡细胞/总细胞×100%。

3.7Western blot检测p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平 将保存于-80 ℃的各组脑组织各取100 mg左右提取组织蛋白，采用RIPA裂解液提取各组脑组织的组织蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，每孔上样30 μL蛋白样品，采用12%的SDS-PAGE进行分离后，转印至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉进行室温封闭1 h，经TBST洗涤后加入相应的 I 抗在4 ℃下孵育过夜，TBST再次洗涤后，加入特异性 II 抗，进行室温孵育1 h，洗膜，ECL化学发光试剂对其曝光显影，拍照保存。

4 统计学处理

数据处理和统计分析均采用SPSS 19.0软件进行。实验数据用平均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 黄角颗粒对大鼠神经功能评分的影响

假手术组大鼠无神经功能缺损，其苏醒后可正常活动；模型组大鼠出现神经功能缺损，其苏醒后均出现肢体活动障碍；黄角颗粒组大鼠苏醒后出现轻微的肢体活动障碍。与假手术组相比，模型组大鼠的神经功能缺损程度出现明显加重(P<0.05)；与模型组相比，黄角颗粒组大鼠的神经功能缺损程度明显减轻，其差异具有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1各组大鼠神经功能评分、脑梗死体积百分比和脑细胞凋亡率

Table 1. The neurological function scores, the percentage of cerebral infarction volume and cell apoptotic rate of brain were measured in rats (Mean±SD.n=10)

GroupThe neurological function scoreThe percentage of cerebral infarction volume (%)Cell apoptotic rate of brain (%)Sham operation005.85±0.83Model2.87±0.65∗31.38±3.53∗65.78±8.97∗Huangjiao granule1.53±0.58∗#19.17±3.38∗#41.06±5.46∗#

*P<0.05vssham operation group;#P<0.05vsmodel group.

2 黄角颗粒对大鼠脑梗死的影响

TTC染色结果显示，假手术组大鼠脑组织未出现白色梗死灶；模型组大鼠脑组织出现明显的白色梗死灶，脑梗死体积百分比为(31.38±3.53)%；黄角颗粒组大鼠脑组织出现轻微梗死，脑梗死百分比为(19.17±3.38)%。与假手术组相比，脑梗死百分比明显增加(P<0.05)；与模型组相比，黄角颗粒组大鼠脑梗死百分比明显减少，其差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

Figure 1. TTC staining of rat brain tissue in each group.

图1各组大鼠脑组织TTC染色图

3 黄角颗粒对大鼠脑组织病理结构的影响

HE染色结果示，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织细胞的固缩核和神经元染色均显著增加，神经元细胞损伤程度加重；与模型组相比，黄角颗粒组大鼠细胞的固缩核和神经元染色均显著降低，其神经元细胞损伤程度减轻,见图2。

Figure 2. HE staining of rat brain tissue in each group (×200).

图2各组大鼠脑组织HE染色图

4 黄角颗粒对大鼠脑细胞凋亡的影响

TUNEL检测结果示，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织可见大量凋亡细胞(P<0.05)；与模型组相比，黄角颗粒组大鼠脑组织凋亡细胞数明显减少(P<0.05)，见表1、图3。

Figure 3. TUNEL staining of rat brain tissue in each group (×400).

图3各组大鼠脑组织TUNEL染色

5 黄角颗粒对大鼠脑组织中p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的影响

Western blot实验结果显示,假手术组大鼠脑组织中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平较低，而模型组大鼠脑组织中可检测到大量p-JAK2和p-STAT3蛋白(P<0.05)；与模型组相比，黄角颗粒组大鼠脑组织中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平显著降低(P<0.05),见图4。

Figure 4. The protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in the rat brain tissues in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham operation group;#P<0.05vsmodel group.

图4各组大鼠脑组织p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达

讨 论

脑缺血再灌注损伤是一个极其复杂的病理生理过程，其发病机制涉及到细胞凋亡、炎症反应、兴奋性氨基酸的释放增加、能量障碍、自由基的产生、细胞自噬以及氧化应激等[10],是大多数缺血性脑血管病的主要病理生理机制。目前，缺血性脑血管病的发病率较高，且其致残率和致死率均较高，严重危害人类的身心健康，因此，寻找有效的药物减轻脑缺血再灌注损伤显得尤为重要。本研究采用线栓法构建大鼠脑缺血再灌注模型，探讨黄角颗粒预处理对IRI的影响及其相关机制，结果表明，脑缺血再灌注损伤模型大鼠出现神经功能缺损状态，其脑组织出现脑梗死病灶以及神经元损伤等病理状态，脑组织细胞凋亡增加，脑组织中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平增加；提前给予黄角颗粒治疗的脑缺血再灌注损伤大鼠的病理损伤明显减轻，脑组织细胞凋亡显著减少，脑组织中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平显著降低，提示黄角颗粒对脑缺血再灌注损伤具有显著的抑制作用。

JAK/STAT信号通路与脑缺血再灌注损伤密切相关，其可通过调节基因转录模式的变化，进一步调控细胞存活或死亡而影响脑缺血再灌注损伤的发生发展[11-12]。JAK/STAT信号通路由Janus酪氨酸激酶家族JAK、信号转导和转录激活蛋白STAT组成。JAK2蛋白主要在大鼠大脑神经元胞质内和少数胶质细胞内表达；STAT3蛋白则广泛分布在大鼠整个大脑神经系统[13]。JAKs通常与细胞因子、生长因子等细胞膜上的受体结合并磷酸化而激活，磷酸化的JAKs催化STATs发生自身磷酸化后，转移到细胞核内，与特定DNA序列相结合而激活目的基因表达[14]。生理状态下，JAKs和STATs的磷酸化在大鼠脑中正常表达，而发生脑缺血再灌注损伤时其表达量则显著增加[15]。刘荣等[16]的研究表明局灶性脑缺血大鼠脑组织中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平高于假手术组，即脑缺血导致JAK2/STAT3信号通路异常激活，可能为脑缺血再灌注损伤加重的机制之一，而电针治疗脑缺血可下调p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平，阻断JAK2/STAT3信号通路的异常活化。JAK2/STAT3信号通路具有快速激活的特征，当细胞因子、生长因子等配体与细胞膜上的相应受体相结合形成JAKs结合位点，一方面，JAKs与相应位点相结合后发生自身磷酸化而激活JAKs，另一方面，活化后的JAKs与STATs蛋白相结合而激活目的基因表达[17]。因此，本研究检测磷酸化的JAK2和STAT3的表达水平，结果表明模型组大鼠脑组织表现出高水平的p-JAK2和p-STAT3，而假手术组仅见少量蛋白，可推测JAK2/STAT3信号通路的异常激活在脑缺血再灌注损伤中具有重要作用。在提前给予黄角颗粒干预后，黄角颗粒组大鼠脑组织中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平下调，即表明通过抑制JAK2/STAT3信号通路的异常激活可能是黄角颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠发挥保护作用的机制之一。

综上所述，黄角颗粒可显著改善脑缺血再灌注大鼠的病理损伤，减少脑组织细胞凋亡，其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路的异常激活相关，但其是否还通过其它信号通路联合发挥作用尚需进一步更深入的研究。