慢性心衰患者血管性血友病因子活性及其基因多态性的相关性研究

宋金萍， 卢佩佩， 王昌敏， 黄艳春

(1新疆医科大学第三临床医学院临床检验教研室， 乌鲁木齐 830011； 2新疆维吾尔自治区人民医院临床检验中心， 乌鲁木齐 830001)

近年来的大量研究发现血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)水平上升是心血管疾病的危险因素，特别是在栓塞性心血管疾病中有大量的研究[1-3]。血管内皮细胞损伤是多种心血管疾病的共同病理基础，并在静脉血栓发展进程中起关键作用[4-5]。慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)患者血液呈高凝状态，是血栓形成的高危人群，其体内存在明显的内皮细胞损伤，且损伤程度与心衰程度一致。vWF作为内皮细胞损伤的标志物，随心衰的加重而在血浆中的水平增高[4]。最近的研究证实vWF过表达在心血管事件和动静脉血栓形成中具有重要意义。遗传变异是血栓性疾病最主要的原发性危险因素，凝血系统基因多态性是研究方向之一[6-7]。vWF促进血小板的活化和聚集，充当凝血因子Ⅷ载体，延长其半衰期，是血小板血栓和纤维素血栓形成的关键因素之一。vWF18外显子rs1063856多态性位点位于与凝血因子Ⅷ和血小板结合的基因序列，该位点错义突变可导致血浆vWF水平升高及与凝血因子Ⅷ的亲和力不同[8-9]，主要与血栓形成有关。鉴于vWF在心血管疾病和血栓形成中的重要作用，本研究期望通过对vWF基因多态性与慢性心衰相关病例因素及凝血功能改变的相关研究，分析慢性心衰高凝状态的易感或保护基因，探讨CHF患者发生凝血异常的机制，为CHF抗凝治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1研究对象及临床资料慢性心衰组:选取2017年6月-2018年1月来自治区人民医院诊治的60例慢性心衰患者，NYHA功能分级Ⅱ～Ⅳ级，其中男性35例，女性24例。年龄47～83岁，平均(69.49±12.6)岁。纳入标准：参照《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》(2014年，中华医学会心血管病学分)；排除标准：家族遗传性血栓病史；自身免疫性疾病、血小板功能性疾病、出凝血性疾病、急性炎症、全身炎症反应综合征、明显肝肾功能损害、肿瘤、怀孕等；近半年内外科手术、骨折、外伤或脑出血患者。对照组：选取60例同期来我院体检的健康者，年龄49～78岁，平均年龄(68.45±9.72)岁；男性28例，女性32例。按临床资料的相关描述记录所有研究对象的姓名、年龄、性别、疾病史。收集所有患者血小板、凝血功能、尿酸、血糖、血脂、心肌酶谱、超敏C反应蛋白、降钙素原、血流变学等相关项目的检测结果以及心功能评级NYHA、颈部和下肢动脉及静脉多普勒彩超结果。

与正常对照组相比，心衰组患者平均年龄和性别比例差异无统计学意义。心衰组患者以心功能Ⅲ、Ⅳ级占多数，且男性多于女性。病因构成中，冠心病患者占心衰患者的多数，其次为高血压、房颤、心率失常以及心绞痛和陈旧性心肌梗死。慢性心衰患者血小板(PLT)、胆固醇(CHOL)、高密度胆固醇(HDL-C)、低密度胆固醇(LDL-C)明显低于正常对照组(P<0.05)，而血清尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、超敏C反应蛋白(S-CRP)及肌酸激酶(CK)、肌钙蛋白I(cTNi)、肌钙蛋白T(cTNT)、B型尿钠肽(BNP)明显高于正常对照组(P<0.05)。而血清降钙素原(PCT)、甘油三酯(TG)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、红细胞沉降率(ESR)2组差异无统计学意义(表1)。

1.2方法采取研究对象清晨空腹静脉全血2 mL(EDTA抗凝)，置入-80℃超低温冰箱保存，用于DNA的提取；3 mL(3.8%枸椽酸钠抗凝)，3 000 r/min，4℃离心10 min，分离血清或血浆，-80℃保存，1 w内进行凝血指标检测。取EDTA抗凝静脉全血0.2 mL，按全血基因组DNA提取试剂盒说明提取基因组DNA。通过核酸浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳对所提取基因组DNA浓度和质量进行评价，检验合格的样品置于-80℃保存备用。vWF基因SNP位点，采用Primer3软件设计引物序列。rs1063856位点上游引物:5′-GGCAACTCTGAGT-

CTCTT，下游引物:5′-GAAAACTGAAGGGCAGGCACCAG-3′。vWF SNP目的片段扩增：反应体系为50 μL，含模板DNA<500 ng，前引物0.2 μM(终浓度) ，后引物0.2 μM (终浓度) ，PCR Master Mix 25 μL，最后用双蒸水补充至50 μL。在PCR扩增仪上进行扩增。反应条件为：98℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次。取PCR扩增产物3 μL，加上样缓冲液3 μL，在1%琼脂糖凝胶电泳上150 mV，电泳25 min，凝胶成像仪观察，拍照。PCR产物送新疆昆泰瑞生物技术有限公司使用ABI3730xl测序。使用BioEdit和DNAman软件分析实验结果，获得分型数据。

表1 正常对照组与心衰患者临床特点及相关指标的比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05。

2 结果

2.1正常对照组和慢性心衰组凝血功能比较与正常对照组相比，心衰组患者活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(FIB)和D-二聚体(D-DI)浓度、凝血因子Ⅷ(FⅧ)和vWF活性均明显升高(P<0.01)。抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、蛋白C(PC)、蛋白S(PS)活性与正常对照组相比，差异无统计学意义,见表2。

2.2vWF基因rs1063856多态性位点基因型和等位基因的分布情况vWF基因rs1063856(P=0.579>0.5)和rs764124766(P=0.941>0.5)多态性位点基因型的分布符合Hardy-Weinberg定律。vWF基因rs1063856出现AA、AG和GG 3个基因型。其中AA基因型占多数，其次为AG型，GG型只检测到1例。与正常对照组相比，rs1063856位点的基因型和等位基因分布频率差异无统计学意义，见表3。

表2 正常对照组与心衰组患者凝血功能比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05。

2.3vWF基因rs1063856多态性位点基因型和等位基因凝血因子差异比较vWF基因rs1063856多态性位点不同基因型凝血因子Ⅷ、vWF活性及PLT 的数量存在差异,见表4。正常对照组，AG基因型凝血因子Ⅷ活性、vWF活性明显高于AA基因型(P<0.05),而PLT数量则明显低于AA基因型(P<0.05)。而等位基因G(AG+GG)凝血因子Ⅷ活性高于等位基因A(AA+AG)(P<0.05)，vWF活性和PLT数量虽有明显差异，但无统计学差异(P>0.05)。心衰组AG基因型vWF活性明显高于AA基因型(P<0.05)，凝血因子Ⅷ活性AG基因型虽明显高于AA基因型，但无统计学差异(P>0.05)；PLT数量AG型和AA型无显著差异。心衰组等位基因A型与G型相比，PLT数量无显著差异(P>0.05)，凝血因子Ⅷ活性、vWF活性虽明显偏低，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 vWF基因rs1063856多态性位点基型和等位基因的分布情况/例(%)

注: 与正常对照组比较,*P<0.05。

表4 vWF基因rs1063856多态性位点不同基因型的凝血因子Ⅷ、vWF活性及PLT 数量的差异比较

注：与AG基因型比较，*P<0.05； 与G等位基因比较，△P<0.05。

2.4vWF活性与rs1063856基因多态性及其他指标的相关性分析vWF活性与性别、心肌缺血、TG、S-CRP无相关性；与rs1063856多态性位点AA/AG基因型、心功能级别、动脉斑块形成、冠心病、高血压、房颤、心律失常以及APTT、FIB、D-DI、UA 、GLU、BNP等相关(P<0.05),见表5。

3 讨论

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是常见的心血管疾病，危害大，并随着人口老龄化，发病率呈上升趋势。血栓栓塞是慢性心衰患者中较严重的并发症，在心衰病情发展和预后中起着重要作用，也是导致难治性心衰的原因[10]。

表5 慢性心衰患者vWF活性与rs1063856多态性及其他变量的相关性分析

血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是主要由内皮细胞合成分泌，生理状态下参与止血的主要糖蛋白之一。在病理状态下，vWF不但参与高凝状态的形成，同时各类病理因素对于血管内皮的复杂影响也最终反映在血浆中vWF的水平变化上，所以vWF水平与病情发展趋势密切相关。最近研究发现，vWF过表达在心血管事件和动静脉血栓形成中具有重要意义。心衰组患者血浆vWF水平明显高于健康对照组，并与心功能不全级别、心衰程度和血管内皮损伤程度正相关[4,11]。目前认为VTE是遗传和环境异常导致的一种多因素、复杂性疾病，遗传变异是其最主要的原发性危险因素，凝血系统基因多态性是研究方向之一[6,12]。大量研究表明,60%的vWF水平变异是由遗传变异决定的。本次实验验证了慢性心衰患者体内凝血功能异常，高凝状态显著。CHF患者D-二聚体和FIB水平均明显高于正常对照组。同时心衰组患者vWF和凝血因子Ⅷ活性明显高于正常对照组，而PLT数量低于正常对照组。CHF患者体内，凝血因子活性增强，继发性纤溶激活，血栓形成的风险增加。正常对照组和心衰组rs1063856位点均检测到AA、AG、GG 3种基因型，但基因型和等位基因的分布均无组间差异(P>0.05)。在正常对照组中，AA基因型vWF和凝血因子Ⅷ活性低于AG基因型，但PLT数量却高于AG基因型。心衰组中AA基因型vWF活性低于AG基因型，AA基因型凝血因子Ⅷ活性也明显低于AG基因型。且其他凝血指标APTT、PT、FIB、D-二聚体、AT-Ⅲ、 PC、PS在AG基因型和AA基因型中无明显差异(P>0.05)。同时vWF活性与rs1063856基因型相关(P=0.006)。提示心衰患者rs1063856基因型是vWF活性的影响因素。且vWF活性与FIB和D-二聚体水平、FⅧ活性呈正相关。这一结果与王乐见等[13]在vWF、Ⅷ因子水平变化与易栓症患者静脉血栓发生率的关系的研究中相一致。提示vWFrs1063856AG基因型可能是CHF患者高凝状态形成的因素之一，而G等位基因可能是CHF患者高凝状态的的易感基因。然而并非所有的研究结果均一致支持rsl063856的多态性对血浆vWF水平的影响。种群的差异、纳入标准的不同及样本的大小均可能影响研究结果[14]。

心衰组中AA基因型和AG基因型的PLT数量无显著差异，可能是还受到其他病理因素的影响。近几年的研究证明慢性心力衰竭病人存在高尿酸血症[15]。血清尿酸升高会促进血小板的活化,黏附，损伤血管内皮细胞，激活凝血系统，同时还会导致纤溶抑制，最终使血液呈高凝状态，促进血栓形成。本次研究中也发现慢性心衰患者血清UA[(458.35±166.58)μmol /L]明显高于正常对照组[(276.64±53.82)μmol /L](P<0.05)，而心衰组中AA基因型和AG基因型的血清UA浓度无明显差异(P>0.05)。同时影响PLT数量的影响因素还有很多，比如抗凝剂的使用，会诱导体内产生PLT抗体，而导致循环PLT数量的减少；而vWF rs216311多态性也会影响vWF与PLT结合力不同而导致PLT数量的差异[16]。因此心衰患者AA基因型和AG基因型的PLT数量无显著差异的原因，还需要进行其他方面的研究。

vWF活性与心功能级别、BNP水平、心肌损伤标志物(CK、cTNi、cTNT)呈正相关，提示vWF活性水平与慢性心衰患者心功能损害程度一致。而也有研究表明慢性心衰患者血液BNP水平与其高凝状态及心功能损伤程度正相关，认为BNP水平可以反映慢性心衰患者高凝状态的严重程度[17]。vWF活性与慢性心衰的基础性病因的相关性分析，提示vWF活性可能是这类疾病发展成慢性心力衰竭的过程中起重要作用。而vWF活性与慢性心衰患者动脉粥样斑块形成呈正相关(r=0.663,P<0.001)，同时与PLT数量显著负相关(r=-0.303,P<0.001)。而动脉斑块的形成也会造成PLT的消耗。在动物模型的研究中发现在斑块形成之前，血小板即可黏附到易形成斑块的部位，该过程只需内皮细胞的激活，证明抑制vWF的激活可延缓脂质条纹的形成[18]。

心衰患者血栓栓塞的危险性高,而在临床上被及时诊断的仅仅是其实际血栓发生数量的极小部分。改变血液高凝状态，阻断和逆转血栓形成是治疗心力衰竭并发血栓的关键环节。大量研究显示，血浆vWF水平是一个非常有用的心血管疾病的早期诊断和早期预防的指标。而vWF水平监测在心血管疾病中的应用只是在初步阶段[19]，达成更多共识仍然需要更多的时间。