低剂量分割致SD大鼠放射性肝损伤模型的建立

袁 芳， 邹 蕴， 美丽姑·买买提， 夏宏娟， 徐 丽

(新疆军区总医院放疗科， 乌鲁木齐 830000)

既往放射性肝损伤(radiation-induced liver injury，RILD)动物模型的建立采用的方法基本为单次大剂量照射，但在现实中，肿瘤患者放射治疗技术多采用常规分割的调强放射治疗，且肝脏属于更新缓慢的晚反应组织，具备较强的亚致死性损伤修复能力，但增殖能力较弱，因而对分割剂量更敏感[1]。单次分割剂量越大，肝脏耐受剂量越小，放射损伤程度越重。为了更好地研究肝脏的放射性损伤，更符合现在的治疗模式，本研究采用低剂量分割照射建立RILD大鼠模型，探讨成功建立此模型所需的照射剂量，为放射性肝损伤的预防与治疗提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1动物来源及分组36只健康雄性SPF级SD大鼠，均由新疆医科大学医学验动物中心提供[SCXK(新)2011-0004]，体质量180～220 g/只，随机分为对照组(C组)和照射组(R组)，C组大鼠不照射，R组大鼠根据照射剂量分为20(R1组)、30(R2组)、40(R3组)、50(R4组)和60 Gy(R5组)，共6组，6只/组。分组后每组大鼠用苦味酸标记编号。大鼠分笼饲养，每笼3只，自由饮食、饮水，以国家标准啮齿类动物常规饲料喂养，环境温度18～24℃，相对湿度45%～55%，大鼠饲养笼具、饮水瓶定期消毒，使用垫料均经高压灭菌。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。所有大鼠开始实验前在新疆军区总医院动物实验科动物饲养中心[SYXK(新)2011-0003]常规饲养1 w，未发现异常后开始进行实验。

1.2照射条件及方法SD大鼠经3%戊巴比妥钠腹腔注射(0.1 mL/100 g)麻醉后，将大鼠固定在木质的固定板上，确定好大鼠肝脏的位置及肝脏与邻近器官的关系，在体表做好标记，确定照射野大小。照射野3 cm×2 cm×1.5 cm，内侧界为腹中线，外界开放，上界膈顶，下界距上界2 cm(图1a)。用6 MV X射线照射，源皮距(source skin distance，SSD)=100 cm，照射深度=1.5 cm，剂量率：600 cGy/min，照射总剂量分别为20、30、40、50、60，2 Gy/次，每天照射1次，周一至周五照射，周末休息2 d(图1b)。照射过程中详细记录大鼠的生物学行为，包括大鼠精神状态、活动状态、饮食、大便情况、照射野皮肤、有无脱毛及毛色等情况，每天测量大鼠的体质量。

a: 大鼠固定方式及照射野范围 b: 加速器下照射野范围

1.3采血取材每组照射结束后6 h，用3%戊巴比妥钠腹腔注射对存活大鼠进行深度麻醉。固定后打开大鼠腹腔抽取下腔静脉血5 mL，检测肝功能谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的变化。采血后观察肝脏的大体形态：肝脏大小、 形状、质地、颜色。切取照射后的肝脏组织，观察其切面情况，取1 cm×1 cm×1 cm大小的受照肝组织，用10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，5 μm连续切片，行HE染色光镜下观察病理形态。比较各组肝功及光镜下肝组织的变化。放射性肝损伤的病理诊断标准没有明确的标准，本研究中肝脏组织经过HE染色后，通过显微镜(×100)观察，每张切片由两位不同的病理科医生进行观察、描述。

2 结果

2.1各组SD大鼠一般情况比较与C组相比，R组SD大鼠照射野的毛发干枯，不光滑，但没有出现明显的毛发脱落现象，R组大鼠饮食随着照射天数和累及照射剂量的增加，饮食量减少，大部分SD大鼠的体质量仍然是增长状态，但增长幅度逐渐减小，有少数大鼠体质量出现零增长和负增长，负增长的幅度较小，没有大鼠出现体质量明显下降。根据每次更换垫料时的情况，预测照射组各组大鼠的小便量没有明显的减少或增多，但随着照射天数和照射剂量的累及，SD大鼠的大便性状发生变化，照射的剂量和照射次数越多大便越稀。

2.2各组SD大鼠肝脏大体标本比较C组SD大鼠肝脏颜色鲜红，质地软，大小正常；R组SD大鼠照射野内肝脏颜色，照射剂量较低时肝脏颜色无明显变化，照射剂量较大时大鼠肝脏颜色稍暗，与C组大鼠肝脏相比，照射野内肝脏轻度肿大，照射野外肝脏组织没有明显的变化(图2)。

2.3各组SD大鼠病理组织学比较C组正常大鼠肝组织没有明显的变化，累计照射剂量为20 Gy时，照射野肝脏组织镜下也没有明显的改变；累计照射剂量达到30～40 Gy时，照射野肝组织镜下肝窦轻度充血，中央静脉有瘀血；累计照射剂量达到50 Gy时，镜下可见肝窦充血，中央静脉充血，部分肝细胞可见嗜酸样变性；累计照射剂量达到60 Gy时，镜下照射野内肝组织大部分肝窦充血，中央静脉充血，肝细胞肿大呈片状嗜酸样变性、脂肪样变性，部分肝细胞内细胞核可见颗粒样变性。由此可见，随着照射剂量的增加，肝脏组织损伤程度逐渐加重，但仅局限在照射野内，照射野外的肝组织没有明显的变化(图3)。

C组 R1组 R2组 R3组 R4组 R5组

C组 R1组 R2组

R3组 R4组 R5组

2.4各组SD大鼠ALT、AST结果比较与C组比较，R4组SD大鼠的AST值升高，差异有统计学意义(P<0.05)，R5组SD大鼠的ALT与AST值均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，R1、R2、R3组大鼠的ALT与AST至略微升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

3 讨论

RILD是由于肝组织受到一定剂量的放射线照射，肝细胞生理、病理变化引起的肝组织损伤，是继发于肝及邻近器官肿瘤放射治疗最严重的剂量依赖性并发症，RILD是制约肝癌及邻近器官如胃癌、结肠癌、胰腺癌及腹腔肿瘤等放疗的一大瓶颈，是肝癌患者放疗过程中出现的主要并发症，且死亡率较高[2]。其发生主要与肝脏的照射剂量、照射体积、肝硬化、放疗前的肝功能以及是否与其他抗肿瘤治疗同时进行等综合因素有关[3]。正常肝组织照射后会导致放射性肝病，将阻碍肝癌放疗中照射剂量的递增[4]。Zhang等[5]研究结果显示,照射导致的放射性肝损伤增加了放疗患者的死亡率,目前还没有明确的治疗放射性肝损伤的方法。限制正常肝体积辐射暴露剂量仍然是最有效避免放射性肝病的手段。而Yamashita等[6]的研究表明照射剂量的提高能增加肝癌患者的生存率。

表1 不同照射剂量SD大鼠肝功能的变化

注： 与C组比较，*P<0.05。

随着放射治疗技术的提高及放射治疗设备的不断改进，放疗在肝及肝周肿瘤治疗的地位逐步提升，放射性肝损伤是阻碍这些肿瘤放疗最主要的因素，尽可能地减少射线对正常肝脏组织的损伤，才能更好地让放射治疗在这些肿瘤治疗中发挥作用，最大限度地体现出放疗治疗肝脏及肝周脏器肿瘤的价值。

本次研究中，我们选用SD大鼠，给予常规剂量，1次/d、5次/w的治疗方案，完全模拟癌症患者放疗的治疗模式，目的是建立一个常规剂量分割致SD大鼠RILD模型，从而为今后能更好地研究RILD奠定一定的理论基础。为了确定成功建模的照射剂量，本研究将SD大鼠随机分组,分别给予不同的剂量，研究结果显示，累计照射剂量为20 Gy时，照射野肝脏组织肉眼及显微镜下均没有明显改变；累计照射剂量达到30～40 Gy时，照射野肝组织无明显的充血水肿，显微镜下肝窦轻度充血，中央静脉有充血；累计照射剂量达到50 Gy时，照射野肝组织局部轻度充血，肝组织颜色呈暗红色，显微镜下肝窦充血，中央静脉充血，部分肝细胞出现嗜酸样变性；累计照射剂量达到60 Gy时，照射野肝组织局部充血水肿，肝组织颜色呈暗红色，镜下照射野内大部分肝窦充血，中央静脉充血，肝细胞呈片状嗜酸样变性、脂肪样变性，部分肝细胞内细胞核可见颗粒样变性。由此可见，随着照射剂量的增加，肝脏组织损伤程度逐渐加重，但仅局限在照射野内，照射野外的肝组织没有明显的变化。Ogata等[7]研究显示，RILD的病理特点主要是中央静脉、小叶下静脉和肝血窦的闭塞性疾病，形态学特征即中央静脉腔闭塞，红细胞被困在一个密集的网状纤维和胶原纤维网内，小叶中心肝细胞萎缩，腺泡区肝细胞丢失。

血清学指标的检测也是判断肝脏损伤的一项重要指标，研究表明，正常肝脏组织对放疗的耐受性决定了患者是否能承受放疗，一般在放疗后2 w血清AST、ALT、碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)水平升高[8]。本研究中随着照射剂量的增加，大鼠的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的值逐渐增加，R4、R5组和C组比较，AST差异有统计学意义(P=0.023、P=0.001)，R5组和C组比较，ALT差异有统计学意义(P=0.000)，且随着照射剂量的增高，ALT和AST值成上升趋势。Cheng等[9]的研究中大鼠经过单次大剂量20 Gy照射后，2 w后检测血清中ALT、AST和ALP水平明显升高。Kim等[10]的研究中给予大鼠分次照射，6 Gy/次，1 w 1次，连续5 w，检测血清中ALT、AST水平，检测结果照射组高于对照组。Imaeda等[11]对大鼠采取术中全肝照射，剂量分别为单次15 Gy和30 Gy，不同的时间点检测肝功，15 Gy组照射后ALT、AST与对照组相比无差异；30 Gy组照射后4 w和40 w血清中ALT、AST水平明显高于对照组。ALT和ALP对低剂量体积照射敏感，如果3.5 Gy照射剂量给予全肝照射，ALT和ALP将出现异常，结果表明治疗过程中确保部分肝脏不受照射可以降低肝脏毒性的发生率[12]。

本研究中每组内照射野大鼠肝脏的变化不完全一样，部分大鼠肝损伤程度重一些，有小部分大鼠肝损伤程度轻一些，主要原因跟大鼠肝脏的形态、大小及位置有关，我们在解剖过程中发现，麻醉后有些大鼠在摆位过程中，随着移动大鼠腹部，其肝脏位置也会有所变化，大部分大鼠肝脏整体偏向身体右侧，但有些大鼠解剖后发现其肝脏整体会偏向体中线，因此在照射过程中，可能肝脏的照射野会缩小，且肝脏本身增殖修复能力较强，照射的体积越小，其受到的损伤相应也较小。其次，大鼠肝脏分叶较多，结构较复杂，肝叶之间位置容易发生变动，很难保证每次照射的肝脏部位都是同一个位置。因此，在以后的实验中，为了尽量减小由于位置引起的误差，还需要扩大样本量。