伏寒颗粒对冠心病先天伏寒证患者治疗后的血清代谢组学研究＊

魏 岩，姜丽红，郭家娟，崔英子，黄永生

（1.长春中医药大学基础医学院 长春 130117；2.长春中医药大学附属医院 长春 130021）

冠心病心绞痛属于中医胸痹、心痛等范畴。对84 697例冠心病病例分析，中医证候以气阴两虚、气虚血瘀最为多[1],然而临床实践中发现一部分患者具有特征性病情演变规律[2-5]，且整个过程存在顽固的足凉或手足凉，这些患者的病史都有一个共同的相似性：女性患者从月经初潮（二七）即有痛经，足凉或手足凉症状；男性患者从二八开始出现足凉或手足凉，少腹疼痛或遗尿等症状；至五七（女）或五八（男）前，均会出现纳呆、胃胀、胃痛、恶冷食或泛酸、嗳气等脾胃系统症状；至七七（女）或八八（男）后即表现出各系统疾病的症状。其发病历程与《素问·上古天真论》中论述人体肾精变化女子以七为基数，男子以八为基数的时间点相吻合。依据《灵枢·天年篇》记载“母为基，父为楯”的理论，总结归纳为这类人群是由于先天阳气不足，阴寒内盛，因寒伏于人体之虚处，称之为伏寒，提出“先天伏寒”病因学说，“先天伏寒”病因所导致的临床证候有别于阳虚，而是按照一定的规律演化，最后表现为气（阳）虚气滞，寒热错杂证候，

称之为“伏寒证”。在临床上针对“先天伏寒证”的证候特点，而创立伏寒颗粒，全方由仙灵脾、仙茅、巴戟天、黄芪、白术、黄柏、砂仁等药组成，临床疗效确切[6-8]。

代谢组学把人体作为一个完整的系统来研究，这对揭示疾病的复杂机制和药物在人体复杂的代谢模式具有独特的优势，与中医学的整体观、系统观和辨证论治思维非常相似[9]。代谢组学技术能够很明显的区分先天伏寒证病人和正常对照组的血清代谢物，通过对差异代谢物组分的分析、判断，可以更好的理解冠心病先天伏寒证的病变过程及机体内物质的代谢途径和代谢状况[10]，全面解析机体产生变化的病理本质。

1 研究对象

1.1 研究对象来源及分组

观察病例为2010年1月-2010年12月就诊于长春中医药大学附属医院心内科诊断为冠心病心绞痛的患者。选择典型冠心病先天伏寒证患者（实验组）10例，10例体检确定其身体健康的志愿者（正常对照组）。2组在性别、年龄方面经统计学处理，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入标准

冠心病心绞痛的西医诊断标准参照2007年中华医学会心血管病学分会、中华心血管病杂志编辑委员会制定《慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》制定[11]，中医诊断标准参照《中药新药治疗胸痹（冠心病心绞痛）的临床研究指导原则》[12]制定。先天伏寒证诊断标准根据黄永生教授临床经验并结合临床回顾性流行病学调查结果[2]制定。主症：足凉或手足凉，疲乏，善太息，口干，心烦。次症：气短，背痛，胃痛或胀，恶冷喜热食，纳差，失眠。舌脉：舌淡隐青或舌尖红体暗，苔薄白，脉沉弱或沉弦细弱。病史：女患者从月经来潮（14岁左右）即有痛经，足凉或手足凉，男患者从二八（即16岁左右）出现足凉或手足凉，少腹疼痛或遗尿。至35岁（女）或40岁（男）前，即出现胃疼、胃胀、纳呆、恶冷食，或泛酸、嗳气。至49岁（女）或64岁（男）前即出现心痛症状。主症、病史必备，次症兼具2项以上，结合舌象、脉象，即可诊断。

1.3 排除标准

不符合上述诊断标准者；近半年内服用过影响血脂代谢药物或正在使用影响血脂代谢药物的患者；过敏体质及对多种药物过敏者。

1.4 给药方法

冠心病先天伏寒证组给予伏寒颗粒制剂，由长春中医药大学附属医院制剂中心加工，每次1袋，每日3次，温开水冲服。疗程为28天。

2 研究方法

2.1 仪器与试剂

超导傅里叶变换核磁共振波谱仪（AV-600），购自德国布鲁克公司；京立LDZ5-2离心机购自北京医用离心机厂；-80℃低温冰箱购自Nuaire公司；

2.2 样品的采集与处理：

所有患者于给药前后分别空腹采静脉血10 ml，离心，取上层血清样品冷冻于-80℃超低温保存箱中待测。实验时，将血清样品室温解冻后，低速离心机离心（3 000 r/min，15 min），取上清液放入5 mm样品管中，与250 μl重水混合，保持体积在600 μl，待测。

2.3 氢核磁共振（1H-Nuclear Magnetic Resonance，1HNMR）数据采集

在20℃室温的条件下，在AV-600 MHz超导傅立叶变化核磁共振波谱仪上测量。设置相关参数，然后进行采样，得到自由感应衰减（Free induction decay，FID）信号。经过32 k点傅立叶变换得到一维NMR谱图。

2.4 血清样品1H-NMR谱数据处理

以乳酸在1.33 ppm处的双峰定标。积分区间为4.4-0.5 ppm，积分间距为0.002 ppm，将积分数据按每一张谱的总强度归一化之后，以Excel文件保存，以备主成分分析（Principal components analysis,PCA）时使用。

2.5 统计分析

将图谱数据输入到SIMCA-P+软件进行主成分分析。为了消除相关因素如个体差异等对分组的影响,强化组间差异，进一步采用正交信号校正（Orthogonal signal correction，OSC）处理，再进行偏最小二乘法判别分析（Partial least squares projection to latent structure discriminant analysis，PLS-DA）。

3 结果

3.1 各组血清1H-NMR图谱比较（图1）

3.2 治疗前与正常组间血清代谢物OPLS-DA积分图及负载图（图2）

从积分图和相应的负载图可以反映出实验组与对照组比较，血清样本内化合物所产生的1H-NMR图谱的差异。与正常组相比，冠心病先天伏寒证组中丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、脂类化合物等含量较高，而高密度脂蛋白含量则较低。

3.3 治疗前后组间血清代谢物OPLS-DA积分图及负载图（图3）

从积分图和从相应的负载图可以反映出冠心病先天伏寒证组治疗前组与治疗后组比较，血清样本内化合物所产生的1H-NMR图谱的差异。与治疗前组相比，冠心病先天伏寒证患者治疗后组中高密度脂蛋白含量较高，而乳酸、丙氨酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、脂类化合物、N-乙酰糖蛋白等物质含量较低。

图1 各组典型的代谢谱图和相应的化学位移谱峰指认

图2 两组血浆代谢物OPLS-DA积分图及负载图

图3 两组血浆代谢物OPLS-DA积分图及负载图

3.4 各组血清差异代谢物分析（表1）

结合上图及下表我们可以看出，与正常组相比，冠心病先天伏寒证组中丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、脂类化合物等含量较高，有统计学意义（P＜0.05）；而高密度脂蛋白含量则较低，有统计学意义（P＜0.05）。

与治疗前组相比，冠心病先天伏寒证患者治疗后组中高密度脂蛋白有统计学意义（P＜0.05）；而乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、脂类化合物有统计学意义（P＜0.05）。

4 讨论

临床上冠心病先天伏寒证的患者具有“足凉或手足凉”这样突出的症状，临床往往易与阳虚混淆，或误诊为阳虚而治疗。有人利用蛋白质组学技术对先天伏寒证、阳虚证患者的血清样本进行检测，得出伏寒组与阳虚组病人间的差异蛋白点很多，表达上调的蛋白有过氧化物氧化还原酶，纤维蛋白原，补体因子H，角蛋白，补体因子C4。表达下调的蛋白有人体绒模促性激素，维生素D，纤维蛋白原，糖蛋白，胰蛋白酶抑制剂，结合珠蛋白，载脂蛋白等。说明二者在体质上或将来疾病的发生倾向上有所不同[13]。伏寒颗粒针对“先天伏寒证”的证候特点，而创立，功用为温阳益气，辛开苦降，疏肝理气，调整阴阳，使阴阳合治，寒热共调，标本兼顾，辛开苦降，使阴阳调和而其痛自止。有部分研究表明，对30例冠心病先天伏寒证组给予伏寒颗粒制剂，每次1袋，每日3次，疗程为28天。经治疗，冠心病先天伏寒证组的心绞痛疗效、心电图疗效、中医证候疗效的总有效率分别为90%，60%，86.67%；硝酸甘油停减率为46.67%。在治疗后心绞痛疗效方面，将治疗前、治疗14天、治疗28天心绞痛症状积分进行比较，与治疗前相比，治疗14天、治疗28天均可使心绞痛症状积分明显下降；在治疗后中医证候疗效方面，与治疗前相比较，治疗14天、治疗28天均可使先天伏寒证候积分明显下降，与治疗前相比均有统计学意义（P＜0.01）；给予冠心病先天伏寒兼血瘀证患者伏寒颗粒合血府逐瘀颗粒干预，在干预28天后血清hs-CRP、IL-6、TNF-α含量、全血TNF-αmRNA、IL-6-αmRNA表达、Hcy、IL-1β均有不同程度降低，血清ACTH、皮质醇含量均有明显升高。而对于实验组血清TNF-α、皮质醇、ACTH含量、全血TNF-mRNA表达及Hcy、IL-1β改善作用更为明显。说明伏寒方可以针对先天伏寒证候特征而起作用[14-16]。

冠心病先天伏寒证组与正常组的差异代谢物中乳酸是葡萄糖在无氧酵解条件下由丙酮酸降解而产生的，同时伴有三磷酸腺苷的生成。生理状态下不作为主要供能途径，血中乳酸维持动态平衡。心肌供血不足，使心肌摄入氧下降，细胞得不到充分氧供，三羧酸循环反应受到抑制，产生减少，糖酵解增强，可造成乳酸堆积。因此乳酸水平的异常提示机体能量代谢失调。

与正常组相比，冠心病先天伏寒证患者存在着明显的脂代谢异常。主要表现在脂类化合物，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白。流行病学研究表明，高密度脂蛋白胆固醇含量与冠心病呈负相关，低密度脂蛋白胆固醇含量与冠心病呈正相关。本研究中，与正常组相比，冠心病先天伏寒证组中高密度脂蛋白含量较低，低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白含量较高，与流行病学研究结果一致。

谷氨酞胺的变化直接影响机体总氨基酸的代谢，在体内许多代谢途径上发挥重要作用，谷氨酰胺参与分解代谢，使组织对分解代谢、炎症和感染作出最佳反应，因此具有免疫增强效应；谷氨酰胺也被称为机体在应激状态下的“条件必需氨基酸”，对于调节应激状态下细胞代谢和免疫细胞功能有重要意义。而由谷氨酰胺转化生成的谷胱甘肽有非常重要的抗氧化、抗损伤作用，在细胞的自我修复、抗衰老、抗凋亡方面具有非特异性保护作用。丙氨酸是体内重要的非必需氨基酸，丙氨酸是淋巴细胞再生及免疫过程中重要的参与者。

表1 各组血清差异代谢物分析

N-乙酰糖蛋白的出现，说明凝血机制出现异常。因为参与血液凝固过程的纤维蛋白原、凝血酶原和几种凝血因子都是糖蛋白。有研究表明乙酰糖蛋白谱峰的改变可能是高脂血症大鼠模型血瘀的早期生物标记物[17]。同时N-乙酰糖蛋白在调节物质能量代谢，免疫调节等方面有重要作用。

综上分析，冠心病先天伏寒证存在着能量代谢、糖脂代谢、免疫调节等多种代谢通路的异常，是整体多个系统功能共同改变的结果。这些异常可能导致能量生成不足，而产生手足凉，怕冷等临床症状；糖、脂类等代谢障碍有可能导致气血运行不足，气滞血瘀，而出现胸闷，疲乏，气短等临床症状，这与冠心病先天伏寒证的临床表现一致。而血清这些代谢物的改变，说明在“先天伏寒证”状态下，存在着能量代谢异常，供能不足（虚寒[18]）、凝血功能异常（气滞血瘀）、脂类代谢异常（痰浊）、免疫功能异常（热证客观化指标[19]）等一系列表现，这种虚实夹杂、寒热错杂的表现与先天伏寒证的证候特点一致。而从治疗前后结果中分析，伏寒颗粒对乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、脂类化合物、高密度脂蛋白等物质含量改善明显。因此我们认为伏寒颗粒可以调整冠心病先天伏寒证患者的糖脂、能量代谢，并使之代谢网络呈现向正常状态修复的趋势，这可能是伏寒颗粒治疗冠心病先天伏寒证的作用机制，复方药物大都是通过多层次、多系统、多靶点的整合作用协调干预人体的内源性代谢物组来治疗疾病，伏寒颗粒详细的作用机制则仍需进一步扩大样本，深入研究。