普洱茶茶渣中茶多糖的超声波辅助提取及其抗氧化性

丁世环,张嘉杨,鲁群岷

(重庆能源职业学院,重庆 402260)

随着我国茶产业经济的迅速发展,我国茶叶深加工产品的产量也与日递增,茶饮料已成为饮料市场当中,产销量仅次于饮用水和碳酸饮料的第三位产品[1]。中国茶产业发展报告(2017),截止2016年全国普洱茶饮料产值已突破70亿元,产量也将突破300万吨[2]。在产量和产值均实现快速增长的同时,生产普洱茶饮料所遗留的大量茶渣也带来了生产环保问题。虽然部分有一定环保技术能力的公司能够有效的对这些茶渣进行处理,但是大部分公司在处理这些茶渣时,并未将其作为环保垃圾进行专业化处理,而是将其作为普通垃圾随意丢弃,这就可能会在一定程度上影响区域内的环保安全[3]。因此,进一步开发利用普洱茶茶渣,使之成变废为宝,可以有效地解决普洱茶茶渣所带来的环保问题。

茶多糖(Tea Polysaccharide),作为茶叶中的多糖类复合物,是目前茶叶生化成分当中仅次于茶多酚的功能性物质[4]。研究证明,茶多糖具有降血糖、降血压、抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、防辐射、防动脉稠状硬化、增强人体免疫力等多重功效[5]。鉴于茶多糖良好的人体保健价值,如何高效对其进行提取、分离、纯化已成为国内茶叶保健食品行业研究的重要方向[6]。

目前,茶多糖实验室提取的方法主要包括醇沉法、水浸提法,活性酶辅助浸提法、微波辅助浸提法以及超声波辅助浸提法[7]。已有文献证明,采用超声波技术来辅助茶叶中茶多糖的提取具有成本低、功效保持性良好、提取效率高的优势[8]。因此,本研究将以醇沉法为基础,进一步分析超声波辅助提取过程中的可调控试验因素对普洱茶茶渣中茶多糖得率的影响,并筛选确定普洱茶茶渣中茶多糖超声波辅助提取最优的工艺参数。同时,对提取的茶多糖进行抗氧化性研究,以期为拓展普洱茶茶渣中茶多糖的利用途径提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

普洱茶茶渣 四川富正源生物科技有限公司提供;蒽酮、浓硫酸、95%乙醇、H2O2、水杨酸、无水乙醇、丙酮、无水乙醚,硫酸亚铁、邻三苯酚 均为分析纯;

KQ-800KDV型台式高功率数控超声波清洗器 江苏同君仪器科技有限公司;UV1300型紫外可见分光光度计 成都信立邦生物制药有限公司;5810R型台式高速大容量离心机 德国Eppendorf艾本德股份公司;YRE-2050A型旋转蒸发仪 上海玛尼仪器设备有限公司;FD-1A-50小型台式真空冷冻干燥机 上海利闻科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶多糖的制备工艺 普洱茶茶渣预处理:称取一定质量的普洱茶茶渣,粉碎并过40目筛,依次加入等比例的乙醇和无水乙醚进行脱脂处理。以乙醇为溶液,按照一定浸提温度、浸提时间、料液比、超声功率浸提预处理后的普洱茶茶渣,经过高速离心(4000 r/min,15 min)沉淀后,采用真空抽滤的方式除去残留物,滤液在90 ℃条件下进行旋转蒸发浓缩[9];采用浓度为80%的乙醇溶液进行醇沉,醇沉温度为30 ℃,时间为1 h[10];醇沉产物按照4000 r/min的速度离心处理15 min[11],去除上清液,依次采用无水乙醇、丙酮、无水乙醚进行洗涤,每样试剂洗涤3次;将洗涤后的产物通过真空冷冻干燥机,于温度50 ℃,真空度为20～100 MPa的条件下进行冻干处理,将冻干样品取出放置至室温,获得普洱茶茶渣茶多糖样品。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 浸提温度的确定 固定浸提时间为90 min、料液比为1∶40、超声波功率为400 W的基础因素条件,研究不同浸提温度(20、40、60、80、100 ℃)对茶多糖得率的影响。

1.2.2.2 浸提时间的确定 固定浸提温度为60 ℃、料液比为1∶40、超声波功率为400 W的基础因素条件,研究不同浸提时间(30、60、90、120、150 min)对茶多糖得率的影响。

1.2.2.3 料液比的确定 固定浸提温度为60 ℃、浸提时间为90 min、超声波功率为400 W的基础因素条件,研究不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)对茶多糖得率的影响。

1.2.2.4 超声功率的确定 固定浸提温度为60 ℃、浸提时间为90 min、料液比为1∶40的基础因素条件,研究不同超声功率(100、200、400、600、800 W)对茶多糖得率的影响。

1.2.3 响应面试验设计 以单因素试验结果为基础,进行响应面试验,以浸提温度(X1)、浸提时间(X2)、料液比(X3)以及超声波功率(X4)为自变量,茶多糖得率(Y)为响应面值,制定茶多糖提取工艺的4因素3水平响应面法试验设计方案,见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.4 茶多糖得率测定 采用蒽酮比色法用于测定最终样品中的茶多糖含量[12]。

茶多糖得率(%)=m/M×100

式中,m为茶多糖的干重,g;M为供试样品重量,g[13]。

1.2.5 抗氧化性研究

羟基自由基清除率(%)=(A0-(Ax-Ax0))/A0×100

式中,Ao为空白对照样品的吸光度;AX为待测溶液样品的吸光度;AXo为待测溶液样品的底吸光度。

超氧阴离子自由基清除率(%)=(A0-Ax)/A0×100

式中,Ao为空白对照液的吸光度;AX为待测溶液后的吸光度。

1.3 数据处理

利用Design-Expert 8.0软件进行响应面法回归模型的构建以及模型结果的分析[16]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 浸提温度对茶多糖得率的影响 通过图1分析发现,在浸提温度为20～80 ℃的范围内,茶多糖得率随着浸提温度的升高而增加;在浸提温度为80～100 ℃的范围内,茶多糖得率随着浸提温度的升高呈现出缓慢下降的趋势。主要是因为当浸提温度过低时,茶多糖容易提取不充分,而当浸提温度过高时,有可能会导致茶多糖的降解[17]。在浸提温度试验设定范围内,当浸提温度为80 ℃时,茶多糖得率达到最高,为2.02%。因此,在响应面法试验设计方案中,浸提温度的0水平应当为80 ℃为宜。

图1 温度对茶多糖得率的影响Fig.1 The effect of temperatureon the yield of tea polysaccharide

2.1.2 浸提时间对茶多糖得率的影响 通过图2分析发现,在浸提时间为30～90 min的范围内,茶多糖得率随着浸提时间的延长而增加;在浸提时间为90～150 min的范围内,茶多糖得率随着浸提时间的延长而缓慢下降。通常情况下,茶多糖得率与浸提时间之间会存在一个时间平衡点,而低于或超出这个时间平衡点,都会导致茶多糖得率的下降[18]。在浸提时间试验设定范围内,当浸提时间为90 min时,茶多糖得率达到最高,为1.99%。因此,在响应面法试验设计方案中,浸提时间的0水平应当为90 min为宜。

图2 浸提时间对茶多糖得率的影响Fig.2 The effect of extraction timeon the yield of tea polysaccharide

2.1.3 料液比对茶多糖得率的影响 通过分析图3发现,在料液比为1∶20～1∶40 g/mL的范围内,茶多糖得率随着料液比比值的减少而增加;在料液比为1∶40～1∶60 g/mL的范围内,茶多糖得率随着料液比比值的减少而降低。出现这样的变化趋势可能是因为提取的茶多糖会在料液比1∶40的情况下达到饱和状态,如果进一步增大料液比会稀释提取的茶多糖的浓度,从而造成提取率的下降。在料液比试验设定范围内,当料液比为1∶40 g/mL时,茶多糖得率达到最高,为2.04%。因此,在响应面法试验设计方案中,料液比的0水平应当为1∶40 g/mL为宜。

2.1.4 超声波功率对茶多糖得率的影响 通过分析图4发现,在超声波功率为100～400 W的范围内,茶多糖得率随着超声波功率的增加而增大;在超声波功率为400～800 W的范围内,茶多糖得率随着超声波功率的增加而降低。出现这样的变化趋势可能是由于两方面的原因:一是随着功率的增大,反应溶液中产生的气泡越来越多,由此产生隔离现象,从而阻碍了超声波在反应容器中的传播,致使远离超声波源的区域作用效果减弱,从而使整个样品的提取反应不均匀[19];二是功率过大可能会导致茶多糖的降解,从而降低其提取率。在超声波功率试验设定范围内,当超声波功率为400 W时,茶多糖得率达到最高,为1.91%。因此,在响应面法试验设计方案中,超声波功率的0水平应当为400 W为宜。

图4 超声波功率对茶多糖得率的影响Fig.4 The effect of rultrasonic poweron the yield of tea polysaccharide

2.2 响应面工艺参数优化试验

2.2.1 优化试验方案 依据单因素试验的结果,进行响应面法试验的设计。响应面试验设计组合及结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

2.2.2 回归模型构建与方差分析 响应面试验设计及结果见表2。回归方程的方差分析及偏回归系数检验见表3。回归方程为:

由表3回归方程的方差结果可知,F失拟=1.99

由表3中回归方程的偏回归系数检验结果,可以得出如下结论:

在四个试验因素的一次项中,X1、X2、X3对Y的影响极显著(p<0.01);X4对Y的影响显著(p<0.05)。

X1X3、X1X4、X2X3与Y呈正相关;X1X2、X2X4、X3X4与Y呈负相关。其中,X1X4、X2X3对Y的影响呈现出极显著水平(p<0.01);X2X4对Y的影响呈现出显著水平(p<0.05);X1X3、X1X2、X3X4对Y的影响不显著。

图5进一步展示了四个试验因素响应面3D曲线及等高线分布情况。从这6张响应面图的等高线分布情况以及极值点出现情况可以看出,在四个试验因素交互作用中存在理论上的极值。对比6张响应面图中的3D曲线陡峭程度可知,X2与X3交互作用的3D曲线陡峭程度最为突出,这就表明,X2与X3的交互项对Y的影响相对于其它交互项的影响而言,更为显著。同时,6张响应面图3D曲线陡峭程度也与表3中交互项的方差分析结果相一致。

图5 交互项的响应面3D曲线及等高线分布图Fig.5 The 3D curve and contour map of the response surface of the interaction term

表3 回归方程的方差分析结果及偏回归系数检验结果Table 3 Variance analysis and test result of partial regression coefficient of regression equation

2.2.3 最优试验因素参数组合选择与验证试验 利用Design-Expert软件包的极值分析工具对回归方程进行分析,由此可以获得回归方程极值点所对应的试验因素组合,即浸提温度100 ℃、浸提时间120 min、料液比1∶30 g/mL,超声波功率422.95 W,此时茶多糖得率能够取得理论上的最大值2.32%。考虑到超声波仪器的实际可操作性,最佳的试验因素组合取值应为:浸提温度为100 ℃、浸提时间为120 min、料液比为1∶30 g/mL,超声波功率为420 W。

用最佳的试验因素组合进行三次验证试验,分别测定所得样品的茶多糖得率,三个样品的茶多糖得率平均值为2.29%。理论上的茶多糖提得率最大值为2.32%,实际获得值与理论最大值的相对误差为1.31%,在试验误差允许的范围之内,说明回归方程拟合度较高,其最优试验因素参数组合选择较为准确。

2.3 茶多糖抗氧化性试验

2.3.1 羟基自由基清除试验 羟基自由基氧化活性很强,会对人体细胞造成很大的危害,从而致使多种疾病的产生[20]。从图6可以看出,在茶多糖浓度为0.8～3.2 mg/mL的范围内,茶多糖对羟基自由基的清除率随着茶多糖浓度的提升而增加,之后在茶多糖浓度为3.2～4.0 mg/mL的范围内,茶多糖对羟基自由基的清除率略微下降。当茶多糖浓度为3.2 mg/mL时,茶多糖对羟基自由基的清除率达到最高,为60.37%。于淑池等[21]研究证明,龙井茶多糖对羟基自由基的清除率最高可达68.1%。相比之下,经过超声波辅助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖依然对羟基自由基具有较强的清除效果。

图6 茶多糖对羟基自由基的清除率Fig.6 Effect of tea polysaccharideon hydroxyl radical scavenging rate

2.3.2 超氧阴离子自由基清除试验 尽管超氧阴离子自由基是人体内存在的一种相对较弱的氧化剂,但它仍然会通过DNA和细胞膜的破坏而导致人体机体受损。从图7可以看出,在茶多糖浓度为0.8～2.4 mg/mL的范围内,茶多糖对超氧离子自由基的清除率随着茶多糖浓度的提升而增加,之后在茶多糖浓度为2.4～4.0 mg/mL的范围内,茶多糖对超氧离子自由基的清除率呈下降趋势。当茶多糖浓度为2.4 mg/mL时,茶多糖对羟基自由基的清除率达到最高,为53.91%。于淑池等[21]研究证明,龙井茶多糖对超氧阴离子自由基的清除率最高可达72.1%。相比之下,经过超声波辅助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖仍然对超氧离子自由基具有较强的清除效果。

图7 茶多糖对超氧离子自由基的清除率Fig.7 Effect of tea polysaccharideon superoxide anion radical scavenging rate

3 结论与讨论

高茶多糖提取率的最佳试验因素参数组合为:浸提温度100 ℃、浸提时间120 min、料液比1∶30 g/mL,超声波功率420 W。在此条件下得到茶多糖得率的理论值为2.32%。通过验证试验测得实际茶多糖得率为2.29%,实际获得值与理论最大值的相对误差为1.31%,表明回归方程结果可信,最优试验因素组合选择较为准确。

对经过超声波辅助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖进行抗氧化性试验发现,提取后的茶多糖对羟基自由基以及超氧离子自由基均具有较强的清除能力。其中,当茶多糖浓度为3.2 mg/mL时,茶多糖对羟基自由基的清除率达到最高,为60.37%;当茶多糖浓度为2.4 mg/mL时,茶多糖对羟基自由基的清除率达到最高,为53.91%。黄永春[22]等在研究超声波辅助提取茶多糖及其分子量变化后,指出超声波辅助提取会造成茶多糖的降解,从而可能会影响茶多糖的部分应用属性。本实验研究证明,经过超声波辅助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖依然具有较强的抗氧化性,这进一步拓展了经过超声波辅助提取的普洱茶茶渣中的茶多糖的应用方向。