文冠果壳提取物体外抑制HepG2细胞增殖活性部位筛选研究△

张严磊，施欢贤，李世映，段金廒，宋忠兴，唐志书

(陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712083)

文冠果XanthocerassorbifoliaBunge属无患子科Sapindaceae文冠果属，该植物较特殊，是一属一种，原产中国西北，属木本油料植物，为中国特有的民间植物[1]。其叶[2]、花[3]、果壳[4]、果柄[5]、种皮[6]等皆含有多种化学成分，有抗风湿、祛风、消肿止痛等功效，是传统蒙药的一种，临床上主要用其茎秆治疗风湿性关节炎等[7-10]。文冠果是国家战略储备木本油料作物之一，目前对于文冠果资源的开发利用，主要以文冠果种仁油为主；文冠果的茎叶以及果壳、种皮等基本没有开发利用。本课题组前期围绕文冠果资源的叶和果壳做了大量工作，发现文冠果叶提取物[11]及多糖[12]皆有明显的生物活性。文冠果壳占了文冠果果实生物质量的很大一部分，但是基本当作废弃物处理。本课题组前期利用文冠果壳制备了糠醛及活性炭，实现了文冠果废弃物资源的高值化开发利用。本文将就其提取物抑制人体HepG2细胞的增殖生物活性进行探索性研究，从而为文冠果资源的综合开发利用提供理论基础与科学依据。

1 仪器和材料

多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；高速离心机(Thermo Fisher Scientific，美国)；流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；电子显微镜(Olympus Japan)；CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)。

MTT(Sigma USA)；双抗(Hyclone Utah)；DMEM培养基(Hyclone Utah)；四季青胎牛血清(Hyclone Utah)；丝裂霉素C(Sigma USA)；HepG2细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；PI(碘化丙啶)(上海碧云天生物技术有限公司)；文冠果壳(陕西杨凌普天农业科技有限公司)。

2 方法

2.1 样品提取与所需溶液的配制

2.1.1 样品的提取 分别称取6份文冠果壳粉末，每份2.00 kg，按料液比例(m/V)1∶10，分别加入水和10%、30%、50%、70%、95%乙醇水溶液，水浴回流提取，总共提取3次、每次1 h，过滤，合并滤液。滤液浓缩浸膏、冷冻干燥、粉碎，得文冠果壳提取部位(XSHE)A、B、C、D、E、F备用。

2.1.2 样品溶液及对照品的配制 分别精密称取对照品丝裂霉素C(MMc)和各文冠果壳提取部位粉末5.00 mg，分别用空白培养基溶解(超声助溶)，并定容至5.00 mL，分别得到质量浓度为1.00 mg·mL-1的对照品溶液和质量浓度为1.00 mg·mL-1样品溶液母液，-80 ℃保存，备用。

2.1.3 完全细胞培养基的配制 往500.00 mL DMEM培养基中，按比例10∶1加入50.00 mL已灭活的胎牛血清，之后，加入5.00 mL的双抗(100 U·L-1青霉素和100.00 μg·mL-1链霉素)，摇匀，即得。

2.2 细胞培养

将HepG2细胞置于25.00 mL细胞培养瓶中，用移液枪吸入5.00 mL的完全培养基，吹匀，放置于恒温37 ℃、5% CO2的培养箱培育，待HepG2细胞生长达到95%融合度时，加入0.25%的胰蛋白酶2.00 mL消化，传代，3 d传代1次。

2.3 细胞冻存

待HepG2细胞生长达到95%汇合度时，用2.00 mL 0.25%的胰蛋白酶消化，加入2.00 mL的冻存液[空白培养基-二甲亚砜-胎牛血清(5∶4∶1)]，吹打，使HepG2细胞脱离瓶壁，之后将HepG2细胞转入冻存管中，分别在4 ℃、-20 ℃恒温30 min、-80 ℃恒温72 h后，液氮保存。

2.4 不同溶剂XSHE抑制HepG2细胞增殖活性部位筛选

2.4.1 实验分组 空白组：100.00 μL完全DMEM培养基；样品组：质量浓度分别为25.00、50.00、100.00 μg·mL-1文冠果壳不同溶剂提取物；每组设6个复孔。

2.4.2 HepG2细胞增殖活性检测 待HepG2细胞生长达到95%汇合时，用2.00 mL 0.25%的胰蛋白酶消化后，加入2.00 mL的完全培养基，吹打，使HepG2细胞脱落瓶壁。之后用移液枪将细胞吹匀，计数后，按细胞接种浓度为2×105个·mL-1用培养基调整，接种至96孔板上，接种体积为100.00 μL/孔。放置于5% CO2的培养箱中，37 ℃恒温培养，24 h后将100.00 μL“2.4.1”中各组药物加至96孔板中，培养24 h后将MTT溶液15.00 μL加至各培养孔，放入培养箱孵育4 h后去除培养基，加入150.00 μL DMSO，放回培养箱，孵育15 min后在波长450 nm下测吸光度(A)值，按公式(1)计算细胞抑制率。

细胞抑制率(%)=[1-(A空白-A样)/A空白]×100%

(1)

2.5 95% XSHE对HepG2细胞增殖及细胞形态的影响

2.5.1 实验分组 空白组：100.00 μL完全DMEM培养基；阳性对照(MMc)组：质量浓度为75.00 μg·mL-1；样品组：质量浓度分别为12.50、25.00、50.00、75.00 μg·mL-1的95% XSHE；每组设6个复孔。

2.5.2 95%XSHE干预后HepG2细胞增殖活性检测待HepG2细胞生长达到95%融合时，用2.00 mL 0.25%的胰蛋白酶消化后，加入2.00 mL的完全培养基，用移液枪吹打，使细胞脱落瓶壁。轻轻将细胞吹匀，在计数板计数后，按细胞接种浓度为2×105个·mL-1用培养基调整，接种至96孔板上，接种体积为100.00 μL/孔。放置于5% CO2培养箱中，37 ℃恒温培养24 h后，将100.00 μL 2.5.1中各组药物加至96板中，将细胞放回培养箱，培养24 h，之后将15.00 μL MTT溶液加至培养孔放入培养箱孵育4 h后去除培养基，加入150.00 μL DMSO，放回培养箱，孵育15 min后在波长450 nm下测A值，按公式(1)计算细胞抑制率。此外，在电镜下，观察HepG2细胞在不同浓度的95%XSHE干预后的形态变化，拍照，分析。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 不同溶剂XSHE抑制HepG2细胞增殖活性的筛选结果

利用经典的MTT法分析文冠果壳各溶剂提取物对HepG2活力的影响，结果如图1所示。在25.00～100.00 μg·mL-1，文冠果壳各提取物中除文冠果壳水提物、文冠果壳10%乙醇水溶液(10% XSHE)表现出促进HepG2增殖作用外。其余溶剂提取物对HepG2细胞表现出不同程度的毒性作用，且与空白组相比有显著性差异(P< 0.01)。其中，95% XSHE对HepG2细胞活力的抑制效果尤为明显，且表现出良好的量效关系。当95% XSHE给药质量浓度为100.00 μg·mL-1时，其对HepG2细胞毒性作用达到(72.68±0.21)%。

注：与空白组对比，**P<0.01，*P< 0.05；下同。图1 不同溶剂XSHE对HepG2细胞抑制作用

3.2 95% XSHE对HepG2细胞增殖的影响

基于3.1初步筛选结果，本课题组进一步研究95% XSHE与HepG2细胞增殖之间的量效关系，结果如图2所示。不同浓度95% XSHE对HepG2细胞活力均展现了较好的抑制作用，相较于空白组，有统计学差异(P<0.01)，且给药浓度与HepG2细胞存活率之间表现出良好的负相关性，当95% XSHE给药浓度为75.00 μg·mL-1时，其对HepG2细胞增殖的抑制率高达(80.44±2.33)%，高于等浓度的阳性对照MMc组(P<0.05)。

图2 95% XSHE对HepG2细胞增殖的影响

3.3 95% XSHE对HepG2 细胞形态的影响

通过比较各组细胞形态，可以看出HepG2细胞在不同浓度95% XSHE干预后其形态有较为明显变化，结果如图3所示。正常情况下，HepG2细胞贴壁紧凑，细胞间隙小，形态不一，假足向周围铺展，边缘难分；与空白组相比，HepG2细胞在不同质量浓度95% XSHE干预后，细胞皱缩，并且随着给药质量浓度的上升，细胞皱缩越发明显，细胞间隙变得更大，尤其是在质量浓度为75.00 μg·mL-1的95% XSHE干预下，细胞皱缩成圆形尤为明显，细胞假足几乎不向周围铺展，边缘易见，细胞间隙最大，并且有从培养板脱落的趋势。而在阳性药MMc干预下，细胞同样可见上述现象，且漂浮于培养板。

图3 95% XSHE对HepG2细胞形态的影响

4 小结与讨论

本研究结果显示，在25.00～100.00 μg·mL-1，文冠果壳各提取物中除水提物、10%乙醇水溶液的XSHE对HepG2细胞活力没有明显抑制作用外，文冠果壳其余溶剂提取物均对HepG2细胞活力有抑制作用，相较于空白组而言，皆有统计学差异(P< 0.01)。其中，95% XSHE抑制HepG2细胞活力效果最强，当95% XSHE 的给药质量浓度为75.00 μg·mL-1时，其抑制作用能达到(80.44±2.67)%，高于等质量浓度的阳性对照MMc。此外，研究还发现，质量浓度为100.00 μg·mL-1的95% XSHE对HepG2细胞的抑制作用不如75.00 μg·mL-1的95% XSHE强；分析认为，可能是由于100.00 μg·mL-1的XSHE对HepG2细胞呈现了一定的促增殖作用，也可能是药物质量浓度过大，在酶标仪下有较大的吸收，从而干扰了测量结果。HepG2细胞在95% XSHE干预下形态发生变化，具体表现为细胞皱缩，细胞间隙变大，从培养板脱落等作用。

综上结果表明，冠果壳提取物在体外具有良好的抑制HepG2增殖的生物活性，为我们进一步探索文冠果壳提取物抗肿瘤作用机制奠定了基础。