不同年限及不同干燥方法的辽细辛中主要成分的含量测定△

张晓婉，黄健，宋冬梅，董育瑄，王晶，路金才，贾凌云*

(1.沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016；2.辽宁和悦医药科技有限公司，辽宁 沈阳 110180)

辽细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)kitag.为马兜铃科植物北细辛、汉城细辛的干燥根及根茎，主产于辽宁的抚顺、丹东、吉林长白山以及黑龙江等地。细辛具有解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮等功效[1]。现代市场上常见的细辛干燥方法一般都阴干，该方法干燥时间长，不仅影响中药草质量和经济价值同时也直接影响产品的使用和外观[2]。而细辛的主要化学成分包括甲基丁香酚、细辛脂素、黄樟醚、榄香素等挥发性成分以及木脂素类的细辛脂素和痕量的马兜铃酸[3-4]。其中马兜铃酸A在长期服用后可引起肝脏和肾脏的损坏与衰竭[5]，因此马兜铃酸的含量对于细辛药材的安全性起到了关键的作用。因此，本文通过检测甲基丁香酚、细辛脂素以及马兜铃酸三种成分为指标，对不同年限以及不同干燥方法进行分析比较，为完善细辛采收和后续加工方法提供科学依据[6]，3种成分的化学结构式见图1。

图1 马兜铃酸(a)、细辛脂素(b)、甲基丁香酚(c)结构式

1 仪器与材料

Waters 2707-2489-1525分析液相，WD900B型微波炉(输出功率900W，额定微波功率2450 MHz，顺德格兰仕电器厂有限公司)，WS70-1型红外线快速干燥器(功率500 W，电压220 V，上海锦屏仪器仪表有限公司)，SCIENTZ-10ND冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，BS124S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，KQ5200E型数控超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，高速多功能粉碎机(28000 r·min-1，上海缘沃工贸有限公司)，XMTH数显控温仪(浙江余姚市远东数控仪器厂)，RE52CS旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，B-220恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)。

马兜铃酸A、细辛脂素对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，HPLC质量分数均大于98%，批号分别为wkq15122902、wkq16071301)，甲基丁香酚对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号为111642-200301)，甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)，水(纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司)。

野生辽细辛新鲜药材于2017年9月，采自辽宁省抚顺市北四平乡，由沈阳药科大学中药学院贾凌云副教授鉴定为辽细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)kitag.。

2 方法与结果

2.1 细辛的干燥品制备

测定所用的干燥品均用六年生辽细辛鲜品30 g进行干燥，以连续两次干燥后称重的差异小于5 mg为指标判断干燥是否完全。不同干燥方法处理后的干燥品的质量约为14 g，最后确定的干燥时间为：阴干12 d、50 ℃烘干6 h、70 ℃烘干1.5 h、微波干燥4 min、红外干燥1 h、冻干1 h。

2.2 HPLC法测定马兜铃酸、细辛脂素和甲基丁香酚的含量

2.2.1 马兜铃酸、细辛脂素和甲基丁香酚的色谱条件和系统适用性 色谱柱：COSMOSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)为72：28等度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：316 nm；进样量：10 μL；柱温30 ℃。在此色谱条件下，理论塔板数以马兜铃酸A计算不得低于5000，相邻色谱峰的分离度应大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，色谱图见图2。

图2 马兜铃酸对照品溶液色谱图

色谱柱：COSMOSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脱程序：0～10 min，ö(A)55%～60%；10～15 min，φ(A)60%～65%；15～30 min，φ(A)65%～71%；30～35 min，φ(A)71%～55%；流速：1.0 mL· min-1；检测波长：285 nm；进样量：5 μL；柱温30 ℃。在此色谱条件下，理论塔板数以细辛脂素计算不低于10 000，相邻两峰的分离度应大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，色谱图见图3。

图3 对照品溶液(A)和供试品溶液(B)色谱图

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照储备液 取马兜铃酸A 10.16 mg，置25 mL的容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，再吸取1 mL置10 mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，获得浓度为40.64 mg·L-1的马兜铃酸A对照储备液。另取甲基丁香酚10.53 mg，细辛脂素14.46 mg分置10 mL容量瓶，再分别取1 mL和0.5 mL的储备液于10 mL的容量瓶中，分别获得浓度为105.3 mg·L-1和72.3 mg·L-1作为细辛脂素和甲基丁香酚的混和对照储备液。

2.2.2.2 供试溶液 取不同年限及不同干燥方法的辽细辛药材粉末各1 g，置25 mL锥形瓶中，超声提取3次，每次加5 mL分析甲醇。过滤后合并提取液，甲醇溶解并定量转移至10 mL容量瓶中，过滤(0.22 μm)，取续滤液即为马兜铃酸的供试溶液。再取不同年限及不同干燥方法的辽细辛药材粉末各0.5 g，置100 mL锥形瓶中，加入20 mL甲醇，称重。水浴回流1小时，取出，放冷，称定重量，用甲醇补足减失重量，过滤(0.22 μm)，取续滤液即为细辛脂素和甲基丁香酚的混合供试溶液。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 线性关系的考察 精密吸取马兜铃酸A对照储备液0.5、1.5、2.5、3.5、5.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。各吸取10 μL进行液相分析，再精密吸取“2.3.2.1”项下的对照品溶液1、2、4、8、10 mL细辛脂素和甲基丁香酚的混和对照储备液，按照上述方法获得系列标准溶液后，各吸取5 μL进行液相分析。以对照储备液峰面积(A)为纵坐标，以溶液的质量浓度(ρ，mg·L-1)横坐标，绘制标准曲线，得到马兜铃酸A的回归方程为：A=1.433 5×104ρ+1.06×103，r=0.999 2；甲基丁香酚的回归方程为：A=7×108ρ+4.431 62×105，r=0.999 2；细辛脂素的回归方程为：A=2×109ρ+5.218 68×105，r=0.999 3结果表明，马兜铃酸A、甲基丁香酚以及细辛脂素的质量浓度分别在2.032～22.352 mg·L-1、10.53～105.3 mg·L-1及7.23～723 mg·L-1的浓度范围内呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 精密吸取马兜铃酸对照储备液10 μL及混合对照储备液5 μL，在“2.2.1”条色谱条件下连续进样6次，其马兜铃酸的RSD值为1.54%，细辛脂素和甲基丁香酚的RSD值分别为1.74%、1.55%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 取六年生阴干的辽细辛药材约1 g，按照“2.2.2.2”条方法平行制的6份供试溶液，按照“2.2.1”条色谱条件进样分析，测得马兜铃酸A含量的RSD值为0.94%，另取六年生阴干的辽细辛药材约0.5 g，同理测得其细辛脂素和甲基丁香酚的含量的RSD值分别为1.82%、1.14%，表明方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 取马兜铃酸供试溶液分别于0、2、4、6、8、12 h吸取10 μL注入液相色谱仪，按照“2.2.1”条色谱条件测定峰面积，测得马兜铃酸A峰面积的RSD值为1.14%，同理取细辛脂素和甲基丁香酚混合供试溶液以相同的时间点各吸取5 μL注入液相色谱仪，测得其细辛脂素和甲基丁香酚峰面积的RSD值分别为1.08% 、0.69%，表明供试品溶液在室温下稳定性良好。

2.2.7 加样回收率 称取已知含量的辽细辛药材粉末6份，每份约1 g，精密称定。按照“2.2.2.2”条方法制备供试溶液，并精密加入马兜铃酸对照储备液适量，按照“2.2.1”条色谱条件进样分析，计算马兜铃酸回收率，结果见表1。

表1 马兜铃酸A的加样回收率的结果

再称取已知含量的细辛药材粉末6份，每份约0.5 g，精密称定。按照同样方法制备供试溶液，并精密加入混合对照储备液适量，按照“2.2.1”条色谱条件进样分析，计算回收率，结果见表2。

2.2.8 样品含量测定 取不同年限和不同干燥方法的辽细辛药材三份，按照“2.2.2.2”条方法制备供试溶液，在“2.2.2.1”的条件下，分别精密吸取不同年限和不同干燥的供试品溶液各10 μL进入液相，以外标一点法计算供试品中马兜铃酸的含量，并计算其他干燥品相对于六年生阴干中马兜铃酸的含量变化率，结果见图3和图4。

表2 细辛脂素和甲基丁香酚加样回收率试验结果(n=6)

图4 不同年限马兜铃酸A的含量

图5 不同干燥方法处理后马兜铃酸A的含量

再取不同年限和不同干燥方法的辽细辛药材三份，按照上述同样的方法制备供试溶液并分别吸取5 μL进入液相计算其甲基丁香酚和细辛脂素的含量及其他干燥品相对于六年生阴干中甲基丁香酚和细辛脂素的含量变化率，结果见表3和表4。

表3 不同年限中细辛脂素和甲基丁香酚的含量

表4 不同干燥方法处理后细辛脂素和甲基丁香酚的含量

3 讨论与结论

细辛药材中马兜铃酸的含量属于痕量，因此考察了药典及相关文献[7-10]的检测波长，结果表明马兜铃酸在316 nm处显示有吸收，故选择316 nm为检测波长。

分别考察了流动相系统在梯度洗脱的条件下对细辛脂素和甲基丁香酚的分离情况，发现使用甲醇-0.1%甲酸水的系统梯度洗脱时分离度相对较好且峰型良好。故选择采用甲醇-0.1%甲酸水作为流动相进行梯度洗脱。

不同年限细辛中马兜铃酸A测定结果表明，马兜铃酸A的含量随着年限的增长而下降，不同方法干燥处理后，马兜铃酸A的含量并未呈明显的趋势性变化且马兜铃酸A的含量均在国家药典规定的0.001% 以下。

现今市场上流通的细辛药材大多都采用阴干的方式来进行加工处理，本实验结果表明采用冷冻干燥法对细辛药材加工过程中有效成分的保留起到一定的作用，有条件的企业可以选择此方法。此外，低温干燥有效成分损失也较小，更适用大规模干燥。

细辛脂素和甲基丁香酚的含量随着细辛种植年限越长，整体的含量也呈现逐年上升的趋势，其中6年生的细辛药材的有效成分含量要优于其他年限，但与5年生相差不大，考虑种植成本等因素，细辛的采收年限为5年较合理。