苦蘵育种F1群体真伪鉴定△

刘玉洋，何金宇，刘朋丽，冯尚国，王慧中，卢江杰

(杭州师范大学 生命与环境科学学院/浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室，浙江 杭州 310018)

苦蘵PhysalisangulataL.为茄科酸浆属草本植物，又称为苦蘵草、天泡草、炮仔草等，在秦汉时期的《尔雅》中已有记载，其果、根和或全草皆可入药，是传统中药材。苦蘵长有短毛或无毛，茎多分枝，叶片呈椭圆形，果实为球形，包于宿萼中，种子为圆盘状，花、果期为5～12个月[1]。现代医学研究表明，苦蘵中含有多种化学成分，主要有甾体类、甾醇类、有机酸、多糖等[2-4]，可用于治疗天疱疮、疔疮、痢疾、感冒、咳嗽等疾病[5]，有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗菌等药理活性[6-9]，具有很高的药用价值和经济价值。苦蘵有效成分含量因地域不同而有一定差异，因此，培育高活性成分的苦蘵新品种，尤其是挖掘现有野生苦蘵种质资源中有效成分含量遗传基础成为育种工作者以及科研人员的重要课题。

高密度遗传图谱是QTL定位研究的重要依据，可为分子标记辅助选择育种提供工具，而分离群体的构建是绘制高密度遗传连锁图谱的关键因素，分离群体质量的好坏也直接决定了遗传图谱构建的难易程度。若分离群体中真杂交种数所占的比例越高，则表明该群体质量越高。因此，快速、准确鉴定出真杂种是评估分离群体质量的重要方法。鉴定分离群体真杂交种的方法主要有形态观察法、同工酶鉴定法、细胞学鉴定法和分子标记鉴定法等[10]，与其他三种鉴定方法相比，分子标记鉴定法更加准确，可以有效的减少人为因素的影响，并且操作简单、方便快捷。SSR分子标记具有共显性强、多态性丰富、稳定性高、分布广泛、数量多、重复性好、模板DNA质量要求不高等特点[11-15]，已被广泛应用于农作物杂交后代真伪的快速鉴定。张敏等[16]利用SSR对鄂茄子2号杂种一代群体进行纯度鉴定，在140份样品中有4份为杂合子，剩余136株均为纯合子，占总数的97%。陆鑫等[17]构建了甘蔗热带种“路打士”与滇蔗茅“云南95-19”的杂交F1代群体，利用4对SSR引物进行62份杂交后代的鉴定，发现杂交真实率高达100%。张宁洁[18]从120对SSR引物中筛选出2对引物用于甘蓝型油菜杂交种纯度的分子标记鉴定，发现油菜杂交群体F1代的纯度在90%以上。

目前对药用植物苦蘵的研究大多集中在有效成分[19]、遗传多样性[20]方面，杂交群体的构建和杂交后代真伪鉴定等研究未见报道。本研究利用SSR分子标记技术对苦蘵杂交群体进行杂种鉴定，为苦蘵高密度遗传图谱的构建和有效成分的QTL定位等相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

实验材料由浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室提供，利用苦蘵临海种源(♀)和浦江种源(♂)构建苦蘵杂交群体F1代，对85个杂交F1后代进行杂交种真伪的分子鉴定。选取新鲜苦蘵叶片，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 实验方法

1.2.1 苦蘵基因组DNA的提取 使用本实验室改良的CTAB法提取苦蘵基因组DNA[21]，与其他方法相比，该方法做了以下改良：将苦蘵叶片充分研磨后，取适量粉末于离心管中，迅速加入适量CTAB-free溶液，离心后除去上清液，本步操作可有效除去叶片中多糖等杂质，确保提取的苦蘵基因组DNA纯度高。

利用紫外分光光度计检测苦蘵基因组DNA浓度以及OD260/280比值，利用琼脂糖凝胶电泳技术检验有无蛋白质、RNA等杂质的污染以及是否降解。待检测合格后，将苦蘵基因组DNA母液稀释至50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存，用于后续PCR扩增实验。

1.2.2 苦蘵SSR引物的初步筛选 本实验所用引物是基于苦蘵转录组测序所得序列设计的SSR引物，由上海生工生物公司合成，共计200对SSR引物。以临海、浦江双亲本和两个杂交后代单株18号和45号的DNA为模板，从200对引物中初步筛选出条带清晰、重复性好、多态性丰富的真实SSR引物，用于后续实验。

1.2.3 PCR扩增反应 PCR反应体系(20 μL)：10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.6 μL，Primer F(10 μmol·L-1)1 μL，Primer R(10 μmol·L-1)1 μL，Taq酶(2U·L-1)1 μL，苦蘵基因组DNA(50 ng·μL-1)1 μL，ddH2O 13.4 μL。

PCR反应程序如下：94 ℃预变性3 min，30个循环(94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸90 s)，72 ℃延伸10 min后，4 ℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ①凝胶制备：用量筒分别量取6%丙烯酰胺80 mL，10%过硫酸铵800 μL，TEMED 50 μL，在烧杯中充分摇匀后，缓慢倒入两玻璃板间，确认无气泡后，插上梳子，水平放置半小时至胶凝固。②电泳：向扩增产物中加入2 μL loading buffer，低速离心均匀后，取3 μL混合液点样。连接电源，200 V恒压电泳1小时。③银染：电泳结束后，从玻璃板中取出凝胶，用蒸馏水漂洗三次，除去凝胶上的缓冲液。用0.1%的AgNO3溶液银染10 min，在蒸馏水中漂洗三次，除去凝胶上残留的AgNO3溶液。将凝胶置于显影液中直至显示出明显条带后，蒸馏水漂洗三次，除去显影液。取出凝胶置于显影板上拍照，用保鲜膜包好，4 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 苦蘵SSR引物的初步筛选

我们选择临海、浦江双亲本和两个杂交后代单株18号和45号的DNA为模板，用于苦蘵SSR引物的初步筛选。经过聚合酶链式反应扩增目的片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染，拍照，得到苦蘵SSR引物初步筛选的电泳图，图1为部分电泳图。

在苦蘵SSR引物初步筛选电泳图中，我们挑选出有清晰条带且在苦蘵双亲间有明显差异的引物(红框标注)用于后续苦蘵杂交群体的真杂交种鉴定研究，最后我们从200对苦蘵SSR引物中初步筛选出56对用于后续分析。

注：图中M为DNA标准分子量；数字编码为所用SSR引物编号；每个方框中为双亲和两个杂交后代。图1 苦蘵SSR引物初步筛选的电泳图

2.2 苦蘵杂交群体的鉴定

我们将初步筛选出的56对SSR引物用于苦蘵杂交群体的真伪鉴定研究，经聚合酶链式反应扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、银染、拍照后，得到两对SSR引物可用于苦蘵杂交群体F1代真杂交种的鉴定。两对苦蘵SSR引物详细信息如表1所示。

表1 筛选出的2对SSR引物信息

根据苦蘵PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，我们将F1代单株的带型分为三种，分别是双亲互补型、母本型和缺失型[22]，如图2所示。双亲互补型是指子代中至少含有一条母本和父本的特征带；母本型是指子代的带型与母本带型相同；缺失型是指子代带型与双亲带型均不相同，缺少一条或一条以上特征带。在真杂交种鉴定过程中，双亲互补型的单株为真杂交种，母本型和缺失型的单株需要用其他SSR引物进一步鉴定。

图2 苦蘵SSR引物电泳带型图

如图3所示，利用引物SSR0959对85个苦蘵杂交群体F1代进行鉴定，在160～200 bp之间，母本临海种源共有2条带且皆为特异性条带，父本浦江种源共有3条带且皆为特异性条带，其中双亲互补型的单株有15个，母本型的单株有70个。因此，SSR0959号引物可以从85个F1代群体中鉴定出15个真杂交种，真杂交种数占苦蘵杂交群体总数的18%。

如图4所示，利用引物SSR0116对85个苦蘵杂交群体F1代进行鉴定，在150～250 bp之间，母本临海种源共有7条带，其中特异性条带有4条，父本浦江种源共有6条带，其中特异性条带有4条，在杂交群体F1代中，除编号30的单株为缺失型以外，其余单株均为双亲互补型。因此，利用SSR0116号引物可以从85个F1代群体中鉴定出84个真杂交种，真杂交种数占苦蘵杂交群体总数的99%。

注：M为DNA标准分子量；1～85为杂交后代单株编号。图3 引物SSR0959对杂交F1群体后代的扩增电泳图

注：M为DNA标准分子量；1～85为杂交后代单株编号。图4 引物SSR0116对杂交F1群体后代的扩增电泳图

利用一对SSR引物鉴定杂交群体的真杂交种，有一定的局限性，无法准确的从杂交群体种鉴定出所有的真杂交种，为确保将杂交群体中所有的真杂交种都鉴定出来，需要用多对引物同时进行鉴定。本研究利用了两对SSR引物对苦蘵的杂交群体F1代进行鉴定，用引物SSR0116鉴定时，只有30号单株的带型为缺失型，而当用引物SSR0959鉴定时，30号单株的带型为双亲互补型即真杂交种。综上所述，利用引物SSR0116和SSR0959可以鉴定出85个真杂交种，真杂交种数占苦蘵杂交总数的100%，因此，本实验中苦蘵杂交群体F1代单株均为真杂交种。

3 讨论

本研究利用SSR分子标记技术对苦蘵杂交群体F1代的真杂交种进行鉴定，为评估苦蘵杂交F1代群体的质量提供依据，为苦蘵高密度遗传连锁图谱的构建以及与重要数量性状相关的QTL定位研究奠定基础。从200对SSR引物中筛选出2对特异性好、稳定性高的引物用于苦蘵真杂交种的鉴定，并且从苦蘵杂交群体F1代中鉴定出85个真杂交种，占杂交群体总数的100%。本研究结果表明，SSR分子标记技术可以用于苦蘵杂交群体真杂交种的快速、准确鉴定。