复合酶法优化提取银杏叶总黄酮的工艺研究△

李凤艳，王凯，朱鹏，孙国平*

(1.深圳市坪山区人民医院，广东 深圳 518118；2.河南大学护理与健康学院，河南 开封 475000)

银杏叶总黄酮具有调节血糖血脂，增加胰岛素敏感性，改善肝功能；能够提高抗氧化能力，减轻脂质过氧化，增加抗氧化酶活性的作用；有效地抑制血小板凝聚，在抗菌、肿瘤、抗癌和神经系统也有保护作用显示较好的生物活性[1]。目前，银杏叶总黄酮的提取工艺主要有传统的水提取、有机溶剂提取和新技术辅助提取法，如微波辅助提取、超声波辅助提取、闪式提取、超临界流体萃取、酶辅助提取等提取技术[2-3]。其中，酶法提取技术近年来受到关注，与传统提取方法相比，酶制剂能有效地破坏植物细胞壁的纤维组织，破坏细胞壁完整性，加快植物中的成分溶出，提高生产效率。较多文献[4-10]仅探讨某一种酶对总黄酮提取率的影响，对复合酶的应用也只是简单的组合进行探讨[11]。因此，本研究将选择三种酶(纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶)通过正交试验，以总黄酮提取率为指标，探讨三种酶组合的配比，并对组合后的复合酶的最佳提取工艺进行深入研究，为银杏叶总黄酮的提取工艺改进提供科学依据。

1 材料、试剂与方法

1.1 材料与试剂

银杏叶，2017年10月采摘于广西壮族自治区桂林，经中国科学院广西植物研究所宁德生助理研究员鉴定为正品银杏叶Ginkgobiloba；芦丁对照品，购自中国食品药品检定研究院，纯度为99.99%；纤维素酶、半纤维酶、果胶酶，均购自上海金穗生物科技有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、甲醇、乙醇等试剂均为分析纯，购自西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

T6紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；XS205型、XS225A-SCS型赛多利斯电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；HHW-4数显恒温水浴锅，上海双捷实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理 采摘后的银杏叶经分选后，放入烘箱，于105 ℃杀青15 mim，后于70 ℃烘干至恒重，然后放入中草药粉碎机粉碎后过60目筛，即得银杏叶粉末。

1.3.2 对照品制备 精密称取芦丁对照品2.46 mg，置于5 mL容量瓶中，加入乙醇超声溶解，定溶至刻度，即得对照品溶液。

1.3.3 样品溶液制备 分别精密称2 g的银杏叶粉末置于锥形瓶中，然后加入一定质量的酶和15 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在一定温度下酶解一定时间后，加入35 mL无水乙醇于70 ℃水浴中提取1 h后，将提取液过滤，滤液定溶于50 mL容量瓶，即得样品待测液。

1.3.4 总黄酮的含量测定 分别精密吸取0.2 mL样品待测溶液置于5 mL容量瓶中，分别加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min后加入0.2 mL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6 min后，再加入2 mL 4%NaOH溶液，摇匀，用纯水定容，静置15 min，以试剂为空白，于504 nm波长处测定吸光值[12]。总黄酮提取率按式(1)计算。

提取率(%)=提取液中总黄酮的含量(mg)/提取所用银杏叶粉末的质量(mg)×100%

(1)

2 结果与分析

2.1 标准曲线建立

分别精密吸取0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.3、0.5、0.7 mL对照品溶液置于5 mL容量瓶中，分别加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min后加入0.2 mL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6 min后，再加入2 mL 4%NaOH溶液，摇匀，用甲醇定容，静置15 min，以试剂为空白，于504 nm波长处测定吸光值。以芦丁的量为横坐标，吸光度为纵坐标，进行回归分析，得到回归方程：Y=0.002 7X-0.020 8(r=0.999 4)，表明芦丁浓度与吸光度具有良好相关性。

2.2 复合酶配比正交试验

为了确定组成得复合酶(纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶)的配比，进行L9(34)正交试验。分别精密称2 g银杏叶粉末9份，按表1分别加入相应的酶和15 mL pH为4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，于50 ℃水浴中酶解1 h，然后按1.3.3项下“加入35 mL无水乙醇”进行样品制备。

结果如表1所示，由相关系数R值由大小可知影响银杏叶总黄酮提取率的次序为：纤维素酶>果胶酶>半纤维素酶，最佳的试验方案为A2B3C2，即由纤维素酶：果胶酶：半纤维素酶=2∶3∶1的配比组成的复合酶。

表1 复合酶配比正交试验结果

由于最佳的配比组合不在实验方案中，因此进行验证实验，同时做未加酶的空白对照。结果复合酶法提取银杏叶总黄酮得率为3.12%，而空白对照提取率为2.62%。由此可见，复合酶能够有效地提高银杏叶总黄酮的提取率。

2.3 复合酶提取工艺优化

影响银杏总黄酮得率的因素主要是复合酶的用量、酶解时间、酶解温度、酶解溶液的pH等，为了探索最佳的提取工艺，进行以下单因素试验。

2.3.1复合酶用量考察 由图1可知，在pH为4.5，温度50 ℃和酶解2 h条件下，银杏叶总黄酮得率随着复合酶用量的增加而提高，当复合酶用量大于0.5%以后，增涨缓慢，还有下降趋势，因此复合酶用量以0.5%为宜。

图1 复合酶用量对黄酮得率的影响

2.3.2 酶解时间的影响 由图2可知，银杏总黄酮得率随着酶解时间的增加而增大，但120 min以后，总黄酮得率增加放缓。这是因为酶解时间越长，酶反应进行越完全，越有利于总黄酮成分的溶出，使黄酮得率提高。因此，酶解时间以120 min为宜。

2.3.3 酶解温度的影响 由图3可知，酶解温度在30～40 ℃时，银杏叶总黄酮得率随着酶解温度上升而增加，40 ℃达到顶点，随后得率随着温度升高而减低，这由于温度升高，有利于提高酶解反应速度，但同时也会破坏酶的活力。因此，酶温度为40 ℃为宜。

图2 酶解时间对总黄酮得率的影响

图3 酶解温度对总黄酮得率的影响

2.3.4 pH的影响 由图4可知，pH的变化对黄酮得率的影响比较明确，pH值在4.0～5.5之间，总黄酮得率随着pH的上升而提高，但当pH超过5.5以后，总黄酮得率开始下降，因此适宜的pH为5.5。

图4 pH对总黄酮得率的影响

2.3.5 复合酶提取工艺优化 在上述单因素试验的基础上，选取4因素3水平L9(34)表头设计，对复合酶用量(0.3%、0.4%、0.5%)、酶解温度(35、40、45 ℃)、酶解时间(90、120、150 min)以及pH(5.0、5.5、6.0)进行正交实验，以探索各因素的相互作用对银杏叶总黄酮提取率的影响，从而明确复合酶提取工艺的最佳条件。结果如表2所示。

表2 复合酶提取工艺正交实验结果

续表2

由相关系数R值和优水平可知，酶法提取银杏叶总黄酮的最佳工艺条件为：酶用量0.4%，酶解温度40 ℃，酶时间120 min，pH 5.5。但该条件并不在实验组里，因此，进行验证实验，结果银杏叶总黄酮的提取率为3.58%。由此可见，优化后的提取工艺能够显著提高了银杏叶总黄酮的提取率(3.58%)，与不加酶(2.62%)相比，总黄酮提取率提高了36.6%。

3 讨论

在上述的单因素研究的基础上，结合正交试验分析，表明复合酶对银杏叶总黄酮提取具有增效作用。纤维素酶/果胶酶/半纤维素的配比为2∶3∶1时对银杏叶的细胞组织具有较强的破壁力。进一步的优化研究表明，优化后的提取工艺能够显著提高银杏叶总黄酮的提取率，与不加酶相比，总黄酮提取率提高了36.6%，而且应用复合酶法，可以降低酶的使用量[13]，提取条件温和。