黄连五种主要生物碱的提取纯化及含量测定△

张纯刚，唐静雅，于琛琛，程兰，康廷国

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116620；2.大连医科大学附属第一医院药学部，辽宁 大连 116620)

黄连味苦，性寒，归心、胃、肝、胆、大肠经，具有泻火解毒、清热燥湿的功效。黄连中含有小檗碱、巴马汀碱、黄连碱，表小檗碱等生物碱都具有较强的药理活性。现代药理研究表明，黄连主要有效成分生物碱类不仅具有抗菌、抗病毒的功效，还具有抗心律失常、改善充血性心力衰竭、扩张冠状动脉、降血糖、降血脂、抗血小板凝集、利胆、抗肿瘤等药理作用，被广泛应用于各种病证的治疗[1]。因此，对黄连五种主要生物碱提取与纯化工艺进行研究对于临床研究有着重要的意义。黄连提取纯化方法很多种，有水提、醇提以及柱层析纯化等[2-7]。《中华人民共和国药典》2015年版一部黄连含量测定项下一测多评法及相关文献报道同时测定四种生物碱的含量[8-15]。本实验采用硫酸水提结合酸溶盐析沉淀的方法提取纯化生物碱，通过优化方法同时检测五种含量较大的生物碱，并计算五种生物碱的含量。基于以上结果，为后续进行的降血糖方面制剂研究提供依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪Agilent 1100 series(美国安捷仑科技有限公司)；硫酸、氯化钠为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)。黄连(批号：C150677)由大连权健中药饮片有限公司提供，经辽宁中医药大学康廷国教授鉴定为正品黄连Coptidis Rhizoma。盐酸小檗碱对照品、盐酸药根碱对照品、盐酸黄连碱对照品、盐酸表小檗碱对照品、盐酸巴马汀对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为Y18N8S48598、Z27A6S2808、ZS0924BE14、H25F3X1、Z23O6L4910，纯度≥98%)。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定盐酸小檗碱对照品、盐酸黄连碱对照品、盐酸表小檗碱对照品、盐酸巴马汀为对照品及盐酸药根碱对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含51 μg盐酸小檗碱、10.2 μg盐酸黄连碱、17.6 μg盐酸表小檗碱、8.6 μg的盐酸巴马汀及2.4 μg盐酸药根碱的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取经提取后的黄连提取物粉末约0.2 g，置50 mL容量瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)溶解，超声处理30 min，放冷至室温后续加甲醇-盐酸(100∶1)定容。精密吸取上述溶液2 mL至10 mL容量瓶中，加入甲醇-盐酸(100∶1)进行定容，再经过0.22 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.1.3 色谱条件 固定相：Eclipse XDB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(45∶55)(每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH 4.0)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：室温；检测波长：345 nm；进样量：10 μL。

2.2 黄连中总生物碱含量测定的方法学建立

2.2.1 专属性试验 分别吸取空白及对照品溶液和供试品溶液，按2.1.3项下色谱条件，分别进样，记录色谱图(图1)。结果表明，在上述色谱条件下五种成分的分离情况及峰形良好，专属性良好。

注：A.供试品；B.对照品；C.空白；1.盐酸药根碱；2.盐酸表小檗碱；3.盐酸黄连碱；4.盐酸巴马汀；5.盐酸小檗碱。图1 黄连五种生物碱HPLC图谱

2.2.2 线性关系 将对照品溶液依次进样2、4、8、10、16、20 μL。得盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的回归直线方程及线性范围，结果见表1。

表1 五种生物碱的回归方程及线性范围

2.2.3 精密度试验 取五种生物碱混合对照品溶液，各重复进样 6 次，测得盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱平均峰面积的RSD依次为1.13%、1.47%、1.76%、1.27%、1.10%，RSD<2%，精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 按既定方法制备供试品溶液，分别于2、4、6、8 h进样10 μL检测。结果盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的RSD依次为0.87%、0.31%、0.97%、0.30%、1.89%，RSD<2%，说明样品在8 h内稳定性良好。

2.2.5 重复性试验 取同一批次的样品6份，照上述制定的方法制备供试品溶液和进行HPLC 测定，测得盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱平均峰面积的RSD依次为1.44%、1.64%、1.92%、1.63%、1.70%，RSD<2%，本方法重复性良好。

2.2.6 回收率试验 采用加样回收率方法考察回收率，结果盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的平均回收率依次为99.85%、100.08%、99.09%、99.69%、101.65%，RSD依次为1.66%、1.50%、1.18%、0.79%、1.34%。表明方法准确可靠。

2.2.7 样品含量测定 按上述色谱条件，以混合对照液进行计算，对盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱五种生物碱进行含量测定，计算五种生物碱含量之和。

2.3 提取工艺研究

2.3.1 酸浓度考察 取黄连饮片粉末约10 g，共3份，分别加0.5%、1.5%、2.5%的硫酸溶液80 mL，加热回流提取3次，每次40 min，滤过，合并滤液，用水定容至200 mL，取上述提取液适量，用甲醇稀释到适当浓度，经过0.22 μm微孔滤膜过滤，按照2.2.7 样品含量测定项下进行测定，测得5种生物碱含量并加和，计算5种主要生物碱的提取率，结果见表2。

表2 酸浓度对五种主要生物碱提取率的影响

从表2 结果可知，随着酸浓度的升高，黄连五种主要生物碱提取率先升高后下降。酸浓度在1.5%时五种主要生物碱提取率达到最高值。

2.3.2 提取时间考察 取黄连饮片粉末约10 g，共3份，加1.5%硫酸溶液80 mL，分别加热回流提取20、40、60 min，提取3次，滤过，合并滤液，用水定容至200 mL，即得，结果见表3。

表3 提取时间考察试验结果

从表3 结果可知，随着提取时间的延长，黄连五种主要生物碱提取率逐渐提高，40 min时和60 min时五种主要生物碱提取率相差较小，因此推测再继续延长时间五种主要生物碱提取率并不会增加，因此选择40 min时黄连五种主要生物碱提取效率最佳。

2.3.3 加液量考察 取黄连饮片粉末约10 g，共3份，分别加1.5%硫酸溶液40、80、120 mL，加热回流提取3次，每次40 min，滤过，合并滤液，分别用水定容至合适体积，即得，结果见表4。

表4 加液量考察试验结果

从表4 结果可知，随加液量的增加，黄连五种主要生物碱提取率逐渐提高，继续增加加液量五种主要生物碱提取率并没有继续提高，加液量为80 mL时黄连五种主要生物碱提取效率最佳。

2.3.4 提取次数考察 取黄连饮片粉末约10 g，共4份，分别加1.5%硫酸溶液80 mL，加热回流分别提取1次、2次、3次、4次，40 min/次，滤过，合并滤液，分别用水定容至200 mL，即得，结果见表5。

表5 提取次数考察试验结果

从表5结果可知，随着提取次数的增加，黄连五种主要生物碱提取率逐渐提高，当提取次数为4次时最高，但是提取3次与提取4次差别很小，考虑提取效率因素，提取3次的黄连五种主要生物碱提取率最优。

2.4 黄连总生物碱纯化工艺研究

2.4.1 Ca(OH)2中和条件的考察 取黄连提取液4份，每份50 mL，分别用Ca(OH)2调节pH 5～6、pH 7、pH 8～9、pH 10，滤过后的滤液分别置于50 mL容量瓶中，加水至刻度。取上述滤液1 mL，加甲醇定容至25 mL，过0.22 μm微孔滤膜，照上述含量测定中要求测定黄连总生物碱含量。取上述各滤液40 mL，分别加盐酸调节pH 1.5～2，加氯化钠4 g，使用漩涡仪搅匀使溶解，在冰箱中静置过夜，抽滤，干燥，收集纯化物，所制得的纯化物主要是由五种主要生物碱组成的，结果如表6。

试验结果表明，pH 5～6 时，黄连中五种主要生物碱加和的得率最大且纯化物纯度较高。采用Ca(OH)2中和硫酸，并滤除沉淀，在沉淀过程中会有部分生物碱沉淀析出，造成过滤后生物碱的部分损失，但是经过Ca(OH)2中和硫酸滤除沉淀后，得到的纯化后的生物碱固体纯度更高了，对后续制备高载药量的黄连生物碱降糖制剂奠定了基础。

表6 Ca(OH)2中和条件下不同pH值考察试验结果

2.4.2 酸沉条件考察 取黄连提取液400 mL，加Ca(OH)2调节pH 5～6，抽滤。分别量取滤液3份，每份100 mL，用盐酸分别调节pH 1.5～2、pH 2～3、pH 3～4，每份样品均加氯化钠10 g，使用漩涡仪搅匀使溶解，在冰箱中静置过夜，抽滤，滤渣在干燥箱中真空干燥(50 ℃)，收集纯化物。结果如表7。

表7 盐酸酸化下不同pH考察结果

试验结果表明，当黄连提取液进行酸沉实验时，随着pH 升高，黄连中五种主要生物碱的得率变小，纯化物纯度降低，pH 为1.5～2时为最优。

2.5 黄连五种主要生物碱含量测定

取黄连提取液1000 mL，共3份，分别加Ca(OH)2调节pH 5～6，抽滤，滤液加盐酸调节pH 1.5～2，加氯化钠100 g，充分搅拌，后在冰箱冷藏静置过夜，抽滤，滤渣干燥(50 ℃)，收集纯化物。含量测定结果见图2。

图2 黄连五种主要生物碱含量测定结果

3 结论与讨论

黄连提取率最优条件是：研磨黄连呈粉末状，加8倍量1.5%的硫酸溶液，煎煮三次，每次40 min。硫酸浓度不宜过高，以免提取时由于水分蒸发，局部浓度过高产生碳化的现象。

五种主要生物碱纯化物纯度最优条件是：黄连提取液采用Ca(OH)2调节pH 5～6，滤液加HCl调节pH 1～2，加5%氯化钠溶液使之溶解，冰箱冷藏过夜，滤饼50 ℃烘干。在黄连生物碱纯化过程中，向提取液中加入Ca(OH)2中和硫酸时，由于Ca(OH)2微溶于水，与硫酸反应时间较长，因此加入Ca(OH)2后需不断搅拌，以促进Ca(OH)2与硫酸充分反应。如果搅拌不充分，则pH测定不准确，对沉淀提纯的结果有较大的影响。虽然在沉淀提纯过程中，有少部分生物碱的损失，不能完全提取纯化出来，但是由于得到的五种主要生物碱纯化物的纯度较高，为制备高载药量的黄连生物碱降糖制剂奠定了较好的基础，得到了纯度较高的原料药。

黄连五种主要生物碱的采用高效液相色谱法进行含量测定方法，五种生物碱分离度符合要求，方法精密度、准确稳定可靠，检测结果准确。