外源一氧化氮与水杨酸对盐胁*迫下小麦幼苗生理特性的影响

张 倩 贺明荣 陈为峰 代兴龙 王振林 董元杰† 诸葛玉平†

（1 山东农业大学资源与环境学院，土肥资源高效利用国家工程实验室，山东泰安 271018）

（2山东农业大学农学院，山东泰安 271018）

土壤盐渍化是影响植物生长、导致农作物减产的主要因素之一［1］。盐胁迫会引起植物形态、生理、生物化学等多方面变化［2］。高浓度NaCl会使植物根部土壤水势降低，根系吸取水分困难从而产生渗透胁迫。同时盐胁迫条件下叶片气孔关闭，植物体内电子运输与光合器官受损，导致光合作用及生产率下降。盐胁迫同样会使植物体内产生大量活性氧，造成脂类、蛋白质和氨基酸的氧化损伤，引起代谢紊乱，最终导致作物产量下降［3］。

一氧化氮（Nitric oxide, NO）和水杨酸（Salicylic acid, SA）是植物体内普遍存在的两种小分子信号物质，且均在植物抵抗生物和非生物逆境胁迫反应中起重要作用［4］。SA与NO的信号应答途径并非孤立的，二者在很多抗逆反应中均存在交互作用［5］。研究表明，SA能够诱导拟南芥中NO的合成，且在一定范围和时间内NO合成量随SA浓度升高而增加［6］。而在烟草的系统获得抗性信号通路中，NO活性完全依赖于SA功能作用［7］。Singh等［8］研究认为，NO与SA能够协同调节植物体内亚砷酸盐胁迫反应信号。在对NO和SA减轻红花的锌毒害作用的研究中发现，复合施用较单独施用缓解毒害效果更加显著［9］。此外，相关研究发现外源施加SA与NO均能缓解镍对龙爪稷幼苗［10］及甘蓝型油菜［11］的毒害作用，但其复配处理效果更具优势。

小麦作为三大粮食作物之一，具有较高的营养价值。有研究显示SA和NO能够提高小麦中波紫外线胁迫抗性，且二者结合施用时效果最佳［12］。而有关外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗生长影响的相关研究尚少见报道。因此本试验以小麦为研究对象，以硝普钠（Sodium nitroprusside,SNP）为NO供体，研究盐胁迫下外源NO和SA单独及复合施用对其幼苗生长、光合色素合成及抗氧化酶系统的影响，以期了解外源NO、SA及其复合施用对盐胁迫下小麦幼苗生长的缓解效应，并揭示其缓解机理，为盐碱土壤上的小麦高产栽培和盐渍化土地的开发利用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2017年9月在山东农业大学资源与环境学院植物营养学实验室进行。供试小麦（Triticum aestivum L.）品种“山农22号”，该品种为山东省栽培面积较广的一种优质高产的小麦品种但耐盐性较差。选取籽粒饱满、大小均匀、无病虫害的种子，经0.1%的NaClO消毒10 min，然后用蒸馏水反复漂洗干净，置于SPX-2501C型人工智能气候箱中25℃下恒温培养。待种子露白后，播于洗净的湿润蛭石中，萌发后用1/2 Hoagland营养液浇灌。待小麦长出两片叶后挑选长势一致的植株洗净根部蛭石后，移栽至盛有1/2 Hoagland营养液的玻璃器皿中，每盆25株，营养液调pH至6.5～6.8，幼苗生长条件的室内昼/夜温度为25/18 ℃，光强为100µmol·m-2·s-1，光照时间14 h·d-1。

1.2 试验设计

试验设6个处理：1) CK: Hoagland营养液处理；2) NaCl: Hoagland营养液+120 mmol·L-1NaCl；3) SA: Hoagland营养液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SA；4) SNP: Hoagland营养液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SNP；5) 1/2(SA+SNP): Hoagland营养液+120 mmol·L-1NaCl+50 μmol·L-1SA +50 μmol·L-1SNP；6) SA+SNP : Hoagland营养液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SA+100 μmol·L-1SNP，每个处理重复3次，每盆每次用250 mL 配制的混合液进行处理。每隔2 d换一次混合液，处理14 d后进行各项指标的测定。

1.3 测定项目及方法

鲜重和干重的测定：采取各部分植株样，用去离子水将其冲洗干净，再用吸水纸吸干，直接测定各部分鲜重（FW）。将新鲜材料放于105℃烘箱中杀青30 min后，在 70 ℃下烘干至恒重，然后测定植株干重（DW）。

光合色素含量的测定：用96%的乙醇将采取的幼叶研磨成匀浆，并在25 mL容量瓶内定容，摇匀后用分光光度计分别测定在665、649和470 nm下的吸光度值，然后利用相关公式计算出叶绿素和类胡萝卜素的含量。

电解质渗出率的测定：相对电导值(%)=第一次电导值/杀死后电导值×100%；

电解质渗出率(%)=（样品相对电导值－对照相对电导值）/（100%－对照相对电导值）×100%。

N、P、K、Na、Ca、Mg含量测定：植株样品经烘干、研磨过筛后，H2SO4-H2O2消化，凯氏定氮法测定全氮含量、钼锑抗比色法测定全磷含量，火焰光度计法测定全钾、全钠含量。植株Ca、Mg含量采用HNO3-HClO消煮，并用原子吸收分光光度计进行测定［13］。

H2O2含量测定：参照Patterson等［14］的方法，采用三氯乙酸（Trichloroacetic acid, TCA）进行冰浴研磨，低温离心后加入磷酸缓冲液和KI溶液于390 nm下进行比色测定。

抗氧化酶活性的测定［15］：取样品加入磷酸缓冲液冰浴研磨，低温离心后超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）活性测定采用氮蓝四唑（Nitro-blue tetrazolium, NBT）法，过氧化物酶（Peroxidase, POD）活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶（Catalase , CAT）活性测定采用紫外吸收法。

1.4 数据处理

采用Excel 2003软件处理数据和绘表，采用DPS 7.05软件进行统计分析，采用最小显著极差法（LSD）进行差异显著性检验（P ＜ 0.05）。

行动主张：建议学院优先从教学管理组织结构进行控制，强调及加强教研室的管理功能，加强教师团队建设及对教师个人能力提升的支持与鼓励，当然也应建立相应淘汰机制。教学单位应合理安排好课程结构，结合学院硬件实施（以及及时申购或添置必要实训设施）、学生层次，设置好课程任务，在课程实施过程中，以师带徒，提高学生能力及加强学院学风建设。

2 结 果

2.1 不同处理对小麦幼苗干鲜重及根系活力的影响

由表1可知NaCl处理显著抑制小麦幼苗的生长。与CK相比，NaCl处理下小麦幼苗的地上部鲜重和干重分别降低45.65%和6.46%，地下部鲜重和干重分别降低55.80%和12.44%，且差异显著。添加外源NO或SA之后都能够缓解盐胁迫，二者的复合处理也可以提高小麦幼苗的地上部和地下部鲜重及干重。其中1/2(SA+SNP)处理地上部鲜重及干重较NaCl处理分别增加67.34%和6.80%，地下部鲜重及干重分别增加76.91%和17.61%，且差异显著，可见其效果最明显。

表1 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗干鲜重及根系活力的影响Table 1 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on fresh or dry matter weight and root activity of the wheat seedlings under salt stress

根系活力是根生命力强弱的综合评价指标，反映植物根系的整体发育状况。由表1可知，与CK相比，NaCl处理可显著降低小麦幼苗的根系活力。SNP 和SA单独处理小麦幼苗根系活力分别较NaCl处理提高52.34%、47.56%； SNP和SA复合处理下其根系活力分别较NaCl处理提高74.26%、61.94%，且差异显著。说明外源NO、SA及其复合处理在盐胁迫下均可促进小麦幼苗根系的生长，提高其根系活力，从而促进植株对营养物质的吸收以及地上部的良好生长，且以1/2(SA+SNP)交互作用效果更明显。

2.2 不同处理对小麦幼苗叶片光合色素含量的影响

由表2可见，盐胁迫显著降低小麦幼苗叶片光合色素的含量。与CK相比，NaCl处理的叶绿素a (Chlorophyll a, Chl a)、叶绿素b(Chlorophyll b, Chl b)和类胡萝卜素(Carotenoid, Car)的含量分别降低16.98%、17.86%、5.03%。随着SNP或SA的添加，Chl a、Chl b和Car 的含量均有明显的提高。其中1/2(SA+SNP)处理提高的幅度更大，且与NaCl处理差异显著，其Chl a、Chl b和Car的含量较NaCl处理分别提高39.58%、24.46%、33.06%。表明NaCl处理对小麦幼苗产生胁迫，而外源N O与S A可以缓解这种胁迫，尤其是1/2(SA+SNP)的复合处理对盐胁迫的缓解效果更明显。

2.3 不同处理对小麦幼苗产生速率和H2O2含量的影响

图1 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗超氧阴离子产生速率（A）及过氧化氢含量（B）的影响Fig. 1 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on generation rate (A) and H2O2 content (B) of the wheat seedlings under salt stress

表2 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗叶片光合色素含量的影响Table 2 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on chlorophyll contents in leaves of the wheat seedlings under salt stress/(mg·g-1 FW)

22变化趋势类似，NaCl处理下显著提高，添加SNP和SA均可降低盐胁迫下H2O2且差异显著，其中1/2(SA+SNP)处理H2O2的累积量降低最为明显。

2.4 不同处理对小麦幼苗丙二醛含量和电解质渗出率的影响

盐胁迫诱导丙二醛（MDA）的积累，促进膜脂过氧化对小麦幼苗的伤害（图2A）。与CK相比，NaCl处理下小麦幼苗叶片和根系中的MDA含量分别提高38.95%、56.29%。添加SNP或SA均可以起到缓解效应，其中SNP和SA交互作用的缓解效应更明显。与NaCl处理相比，1/2(SA+SNP)处理小麦幼苗叶片和根系中的MDA含量显著降低，分别降低15.78%、24.23%，表现出更好的缓解效果。

盐胁迫处理下小麦幼苗的电解液渗出率均显著升高（图2B）。与CK相比，NaCl处理的电解液渗出率提高70.72%。而添加SNP或SA均可以显著降低电解质渗出率，并且SNP和SA交互作用的缓解效应更明显，与其他3个处理相比也具有显著差异。与NaCl处理相比，1/2(SA+SNP)处理小麦幼苗的电解质渗出率降低32.50%，表现出更好的缓解效果。

2.5 不同处理对小麦幼苗抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶（SOD）的活性在NaCl处理下显著降低（图3A）。与CK相比，NaCl处理使小麦幼苗叶片和根系中的SOD活性分别降低18.67%、41.79%。添加SNP或SA可以缓解盐胁迫造成的SOD活性降低，其中SNP和SA交互作用的缓解效应更明显。与NaCl处理相比，1/2(SA+SNP)处理小麦幼苗叶片和根系中的SOD活性显著提高，分别提高14.49%、21.53%，表现出最好的缓解效果。为适应盐胁迫，NaCl处理下小麦幼苗的过氧化物酶（POD）活性显著提高（图3B）。与CK相比，其叶片和根系中的POD活性分别提高10.86%、12.11%。随着SNP和SA的添加，各处理均显著提高小麦幼苗的POD活性，起到缓解盐害的作用，其中SNP和SA复合处理的缓解效应更明显。与NaCl处理相比，1/2(SA+SNP)处理小麦幼苗叶片和根系中的SOD活性分别提高9.12%、7.34%，具有显著差异，表现出最好的缓解效果。

图2 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗丙二醛含量（A）及电解质渗出率（B）的影响Fig. 2 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on MDA content (A) and electrolyte leakage (B) of the wheat seedlings under salt stress

图3 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗SOD（A）、POD（B）及CAT（C）酶活性的影响Fig. 3 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on SOD (A), POD (B) and CAT (C) activity of the wheat seedlings under salt stress

2.6 不同处理对小麦幼苗脯氨酸含量的影响

脯氨酸在植物体内的含量在一定程度上反映植物的抗逆性。由图4可知，在盐胁迫条件下，脯氨酸含量增加，从而小麦幼苗更好地适应盐胁迫逆境。随着SNP和SA的添加，进一步提高了小麦幼苗的脯氨酸含量，起到缓解盐害的作用，其中SNP和SA交互作用的缓解效应更为明显。与NaCl处理相比，1/2(SA+SNP)处理小麦幼苗叶片和根系中的脯氨酸含量分别增加了6.62%、35.55%，差异显著，表现出更好的缓解效应。

图4 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗脯氨酸含量的影响Fig. 4 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on proline content of the wheat seedlings under salt stress

2.7 不同处理对小麦幼苗体内Na及其他矿质元素含量的影响

由表3可知，在NaCl处理下，小麦有幼苗叶片和根系中的Na含量显著增加，分别较CK增加2.67倍和3.57倍。添加外源SNP与SA之后，Na含量有所下降，尤其是1/2(SA+SNP)处理Na含量显著下降。可见1/2(SA+SNP)处理抑制了小麦对Na的吸收。

N、P、K、Ca、Mg的含量在NaCl处理条件下降低，说明过量的Na抑制这些矿质元素的吸收。然而添加外源SNP或SA或SNP+SA可以缓解N、P、K、Ca和Mg含量的降低，并促进小麦幼苗对这些矿质元素的吸收。其中，1/2(SA+SNP)处理结果差异显著。与NaCl相比，1/2(SA+SNP)处理条件下，N在叶和根中的含量分别增加15.49%、27.30%；P在叶和根中的含量分别增加23.04%、21.40%；K在叶和根中的含量分别降低3.08%、97.78%；Ca在叶和根中的含量分别降低45.07%、110.12%；Mg在叶和根中的含量分别降低15.85%、18.87%，且均具有显著差异。

表3 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗矿质元素含量的影响Table 3 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on mineral elements content of the wheat seedlings under salt stress /(mg·kg-1)

3 讨 论

3.1 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗干鲜重、根系活力及光合色素含量的影响

Tariq等［16］研究表明盐胁迫会抑制植物的光合作用、养分平衡、抗氧化酶活性、可溶性物质积累等多种生理过程，进而抑制植株生长。而NO和SA作为生长调节物质可以参与逆境胁迫的多重生理调控。本试验结果显示NaCl处理降低小麦幼苗的干重及鲜重，而添加外源物质可以缓解这种影响，并且SNP与SA复合处理条件下小麦的鲜重和干重较单独施用效果更好，尤其是1/2(SA+SNP) 效果更优。通过测定小麦的根系活力、叶片的叶绿素含量，可以看出SA+SNP显著提高了盐胁迫下小麦的根系活力和叶绿素含量。SA+SNP可以通过提高根系活力来促进小麦对矿质元素的吸收，也可以通过促进叶绿素的合成来提高小麦的光合作用，进而对盐害有很大的缓解作用。有研究表明，外源添加NO和SA能够有效修复亚砷酸盐对水稻根系生长及叶绿素合成的抑制作用［8］，这与本研究结果一致。此外，SNP和SA对盐害的缓解作用还可能是因为对膜功能和抗氧化剂的保护作用。

3.2 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗丙二醛含量和电解质渗出率的影响

在本研究中，N a C l处理增加了小麦幼苗的膜脂过氧化作用，而外源NO和SA，尤其是1/2(SA+SNP)，显著降低了MDA积累。Gunes等［17］研究表明SA可以通过抑制OH-的合成来降低MDA的含量；此外NO可以通过降低和H2O2的积累来降低膜脂过氧化作用［18］。盐胁迫对植物的另一直接毒性作用表现为过量的Na造成了细胞膜电解质渗出率增加。盐胁迫下MDA含量和电解质渗出率的增加会导致小麦的生理生化功能衰退，最终阻碍植株生长。试验表明外源添加SNP和SA可以降低小麦幼苗的电解质渗漏率和MDA含量，其中以1/2(SA+SNP)效果更优。Bastam等［19］研究表明SA可通过促进对离子的吸收和提高抗氧化能力来维护膜功能，从而保护植物免受氧化损伤。外源添加SA和SNP降低电解质渗漏率可能是由于减缓了生物膜的过氧化作用，从而减轻了盐胁迫下小麦质膜受损程度。

3.3 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗抗氧化酶活性的影响

3.4 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗脯氨酸含量的影响

本研究测定了盐胁迫对渗透调节物质含量的影响。在NaCl处理下，外源添加SNP和SA，可以提高小麦幼苗叶片和根系中脯氨酸的含量， 以1/2(SA+SNP)处理效果更好。这可能是由于NO与SA通过促进脯氨酸生物合成的基因表达来影响脯氨酸浓度。有研究表明脯氨酸可以通过和生物大分子（比如DNA、蛋白质）相互作用清除羟自由基，从而稳定生物大分子的结构。Tan等［18］表明NO与SA可以通过诱导脱落酸合成来调节脯氨酸的含量，从而缓解渗透胁迫。因此可以推断，盐胁迫下NO与SA对渗透物质的调节作用可能是其保护小麦幼苗免遭盐害的原因之一。

3.5 外源NO与SA复合调控对盐胁迫下小麦幼苗体内Na及其他矿质元素含量的影响

有研究表明植物对盐胁迫的主要反应是减少K的含量，Na替代K的吸收从而导致营养失衡［23］。在本研究中，NaCl处理增加了小麦幼苗叶片和根系中Na的含量，降低了其它矿质元素（N、P、K、Ca、Mg）的含量。这可能是由于离子间存在竞争排斥作用，高浓度的Na+和Cl-竞争排斥了其他离子的吸收，从而导致小麦矿质养分含量降低。而研究结果表明SNP和SA的复合施用可以促进N、P、K、Ca、Mg元素的吸收，从而提高这些矿质元素在地上部的积累。同样，SA+SNP可以通过提高对其他元素的吸收来降低对Na的吸收。可见SA+SNP可以改善盐胁迫诱导的矿质营养失衡，从而促进小麦幼苗的生长。

4 结 论

与单独添加SNP或SA相比，SA+SNP复合处理更能显著提高盐胁迫下小麦幼苗叶绿素含量、抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性蛋白含量；降低产生速率、H2O2和MDA含量以及电解质渗漏率；提高小麦根系活力，促进其对N、P、K、Ca等矿质营养元素的吸收，同时抑制了Na的吸收，减少小麦体内的Na含量，从而缓解了盐胁迫对小麦生长的抑制作用。本研究条件下，各处理中以1/2(SA+SNP)处理的缓解小麦盐胁迫的效果最优。