拟南芥图位克隆快速初定位系统的建立

阚东阳,柯 学,Walid Ghidan,肖素勤,肖 卿,胡向阳,孔祥祥,黄兴奇,程在全

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2. 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省农业生物技术重点实验室，农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，云南 昆明 650223；3.云南蓝虑商贸有限公司，云南 会泽 650420)；4.中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

图位克隆(Map-based cloning)也叫位点克隆，是基因克隆的经典方法，1986年首先由剑桥大学的Alan coulson提出。它是通过已知位点的分子标记寻找目的基因并确定其物理图谱位置，对基因进行粗定位和精细定位，最终克隆到目的基因的方法。基本步骤包括：筛选与目的基因紧密连锁的分子标记, 目的基因的定位，构建高质量容易操作的大片段基因组文库,目的基因的筛选和鉴定，相比其它基因克隆技术，图位克隆结果更具可靠性[1-6]。

利用图位克隆技术，已从拟南芥和其它多种植物发现了许多功能基因。拟南芥中，克隆到ω-脂肪酸去饱和酶基因[6]，发现IEN2基因编码延伸因子复合物，参与NAD+介导的信号途径[5]，与测序技术相结合发现种子油成分控制基因，克隆了叶绿素荧光LCF3基因[2]和叶形态建成基因ABL1。大豆中，克隆出开花相关基因GmGIa[7]和豆荚籽粒数相关主效基因Ln[8]。水稻中利用InDel和SNP引物精细定位到卷叶基因和抗除草剂基因[9-10]。黄瓜中利用2 971个F2植株将叶绿体发育和叶绿素代谢相关w基因定位于33 kb，利用9497个F2植株定位在8.2 kb[11]。黑麦草中利用图位克隆精细定位了自交不亲和基因座[12]白菜中利用图位克隆首次发现了种皮颜色基因TTG1[13]。

【研究意义】拟南芥(Arabidopsisthaliana)由于其植株小、形态特征简单、生活周期短、基因组小(125 Mb、2n=10、25000个蛋白编码基因)，在遗传学、发育生物学和分子生物学中是模式植物[14]。有Landsberg erecta (Ler)、Columbia (Col)和Wassilewskija (Ws)3种生态型，用于自交系构建[4]，是突变体筛选、基因克隆和功能验证的强有力工具[1]。在拟南芥图位克隆初始工作中，面对数千个分子标记，常常让研究者一筹莫展，需要一一筛选易用性分子标记用于初定位。因此筛选出了一批高效的分子标记，实现了拟南芥中目标基因的快速初定位，可以帮助其他研究者实现拟南芥中目标基因的快速定位。【前人研究进展】随着测序技术的发展和多种植物基因组测序的完成，后基因组的时代到来，开发出了更多的分子标记(RFLP、RAPD、AFLP、INDEL、CAPS、SSR、SNP)，使图位克隆的便利性和效率大为提高。在拟南芥中，已建立了TAIR(http://www.arabidopsis.org/marker)和AMP(http://amp.genomics.org.cn/)等数据平台，在大量数据和信息的支持下，最快甚至几个月就能证实和克隆到新基因[9,15]。即便如此，面对数千个分子标记，研究者也需要花费大量时间去筛选合适的分子标记。【本研究切入点】通过已筛选出一批经反复验证过的高效的分子标记，实现了拟南芥中各条染色体上目标基因的快速初定位。【拟解决的关键问题】为解决拟南芥各条染色体上的目标基因的快速定位提供了一批高效的分子标记。

1 材料与方法

1.1 实验材料

拟南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia生态型(Col)和Landsberg生态型(Ler)，以及二者杂交后代种子经10 mmol/LEMS诱变后，播种筛选出的盐敏感突变体S28株系。盐敏感突变体种子播于MS培养基上进行光照培养筛选，成苗后移栽入有机质盒中于温室培养。培养条件为23 ℃，16 h光照，8 h黑暗。

1.2 DNA提取

取拟南芥鲜叶1张，利用生工“Dzup基因组DNA快速抽提试剂盒”提取基因组DNA，提取方法参照产品说明书。

1.3 分子标记的选择

从拟芥数据库The Arabidopsis Information Resource (TAIR)(http://www.arabidopsis.org/)，和Arabidopsis mapping platform(AMP)(http://amp.genomics.org.cn/)上选择44对分子标记，合成引物进行PCR检测，对Columbia(Col)和Landsberg(Ler)进行分型，从中筛选出易用高效的分子标记。

1.4 PCR扩增及电泳检测

根据引物合成信息，摸索PCR扩增及电泳检测条件。实验按常规进行，电泳检测时琼脂糖凝胶浓度为2 %。

1.5 重组率统计

对筛选出的24个分子标记的PCR扩增产物进行χ2检测，确定其分离比是否符合孟德尔分离定律(即C∶H∶L=1∶2∶1)，计算重组率[重组率(%)=重组配子数/配子数×100]，对目标基因的初定位范围进行判定。

2 结果与分析

2.1 从44个分子标记中筛选出24个平均分布于5条染色体的分子标记用于初定位

进行图位克隆，分子标记的筛选非常重要。有些分子标记特异性不好，检测条件苛刻，在实验中难于利用，大大降低了克隆基因的效率。因此，应选择易用、高效的分子标记。

经过反复验证，从原先选择出的44个分子标记中，筛选出24个分子标记，这24个分子标记平均分布于拟南芥的5条染色体上(图1)，既有靠近着丝粒的标记(1号染色体的1-AC006228-4425、3号染色体的3-AP002062-5445、5号染色体的PHYC)，又有靠近端粒位置的标记(如1号染色体的1-AC007592-0663、2号染色体的Ciw2、3号染色体的3-AL356014-9336、4号染色体的4-AF069442-0706、5号染色体的5-AB009053-9339)。

合成引物(表1)，对24个标记的PCR的扩增反应条件可分为5组进行(1个标记46 ℃退火，延伸20 min；8个标记48 ℃退火，延伸20 min；9个标记50 ℃退火，延伸20 min； 4个标记52 ℃退火，延伸30 min；2个标记56 ℃退火，延伸30 min)，110 V条件下，PCR产物的电泳检测时间有7种(40、50、60、70、80、100和140 min，表2)。在上述条件下，这24个分子标记易于扩增，条带清晰，分辨率好，大大提高了多态性的判断，是用于初定位的理想标记(图2)。

图1 24个分子标记在拟南芥染色体位置上的分布Fig.1 Distribution of 24 markers on chromosomes of Arabidopsis thaliana

表1 24个分子标记及PCR引物信息

表2 PCR扩增及电泳检测条件

2.2 筛选出的分子标记在拟南芥耐盐突变体中实现基因快速初定位

利用拟南芥构建杂交群体，或对野生型和特定株系进行化学诱变或中子轰击获得突变体，根据表型定位克隆其中的突变基因，是通用拟南芥遗传分析策略。通过Columbia和Landsberg生态型杂交获得杂交后，对后代材料进行EMS诱变，从中挑选盐敏感突变体，经过至少2代筛选得到表型遗传稳定的突变材料，用于定位和克隆基因。

从EMS诱变材料中筛选到一株盐敏感突变体S28，在MS平板上表现为根生长受抑制，根长极短(图3)。经平板和光照培养箱培养成苗后，移栽到温室培养，收种后进行播种用作初定位群体。在实验中，利用筛选出的分子标记，完成了50个植株的多态性分析，检测结果清晰明了(图4)。

目标基因在图位克隆中是根据分子标记与基因连锁关系的紧密程度得到定位的。根据电泳结果，对24个标记的在S28群体中的带型是否符合孟德尔分离定律(即C∶H∶L=1∶2∶1)进行χ2检验计算P值(以5 %为标准，大于5 %说明差异不显著，小于5 %说明差异显著)。

通过计算得到5号染色体上的引起的变异最显著，相比其它染色体最不符合孟德尔分离定律，说明5号染色体上分子标记与目标基因存在连锁现象。进一步统计5号染色体上所选分子标记的重组率[重组率(%)=重组配子数/配子数×100]，标记5-AB010070-0918、5-AL163792-1729、PHYC、K6M13和5-AB009053-9339的重组率分别为6 %、2 %、5 %、6 %和12 %。由此判定目标基因应位于小于5 %的2个遗传标记之间，即5-AL163792-1729与PHYC之间，并且靠近5-AL163792-1729的一端(表3)。

C代表Col,H代表杂合，L代表LerC: Col type; H: Heterozygote; L: Ler type图2 24个分子标记的PCR产物电泳图Fig.2 Gel detection of PCR products of 24 markers

3 讨 论

图位克隆初定位是利用分子标记把目的基因定位到染色体的一段区域的过程。拟南芥由于基因组小，染色体少，给初定位带来了便利。本研究建立的初定位系统，能利用24个分子标记，仅50株作图群体就实现了目的基因的染色体初定位，整个初定位实验能在1周内完成。这与Austin等强调的考虑到群体中基因分离重组的概率，至少要50个F2代个体才能观察到可变分离的结论相符[16]，但完成整个图位克隆所需的作图群体通常应大于1000个，特别是精细定位阶段需要大样本量。在拟南芥中，作图距离每缩小10倍，作图群体要增加2000个，才能保证目的基因位置判断的准确性。Lei等利用2650个不育株，对拟南芥雄性不育基因BnMs2进行了精细定位[17]，在做精细定位和克隆时，有时往往也需要构建BAC库[18]，因此，工作量是很大的。对于本实验中，根据遗传分离规律，将目的基因初定位于5号染色体上的区域，下一步应利用5-AL163792-1729与PHYC之间的更多分子标记，加大样本量，逐步缩小区间。

图3 盐敏感突变体S28的表型Fig.3 Phenotype of salt sensitive lines S28

图4 分子标记3-AP002062-5445在50个S28样本中的检测结果Fig.4 Gel image of PCR product for marker 3-AP002062-5445 in 50 samples of S28

分子标记MarkersC∶H∶L分子标记MarkersC∶H∶L1-AC007592-066312∶27∶11Ciw1112∶27∶11F21M1210∶26∶143-AP002062-544517∶24∶091-AC006228-442510∶29∶113-AL356014-933616∶24∶101-AC009324-661313∶25∶124-AF069442-070614∶21∶151-AC010675-864514∶21∶154-AL035526-553613∶23∶14Ciw214∶23∶134-AL079350-698512∶22∶15Ciw310∶28∶124-AL031394-871911∶27∶122-AC007232-478013∶29∶085-AB010070-091822∶22∶06Nga112614∶24∶125-AL163792-172943∶05∶022-AC004681-70218∶33∶09PHYC32∶13∶053-AB024034-181913∶26∶11K6M1316∶28∶063-AB022217-240210∶31∶095-AB009053-933914∶24∶12

图位克隆是基因克隆的经典方法之一，在植物基因发掘中得到广泛运用，但其支撑点是众多的分子标记。利用T-DNA及转座子已获得了20万以上的拟南芥插入突变体，有5万多个遗传标记可选[19]。水稻中已开发了1万多个分子标记，有EST(expressed sequence tags)、RFLPs(restriction fragment length polymorphism)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、RAPD(random amplified polymorphic DNA)、SSR(simple sequence repeat)和SNP(single nucleotide polymorphism)[13,20]。本研究中筛选出的24个分子标记，对于目的基因在拟南芥染色体上的快速初定位十分有效，但在精细定位中，可能会面临从数据库无标记可选，需要重新设计分子标记如INDEL标记。这在有完整基因组数据的拟南芥中相对来说是容易的，但是在遇到基因组背景序列不清楚的物种，或者由于育性难于扩大群体的突变材料时，应利用测序技术与表型数据相结合，开发新的标记，如SNP标记、SCOT标记，以及新的单位点特异性PCR标记(如SCAR、CAPS、dCAPS)等，以实现目的基因的最终精细定位和克隆。

4 结 论

本研究中筛选出的24个分子标记，对于目的基因在拟南芥染色体上的快速初定位十分有效，让检测工作快速集中到染色体上的某一区域。利用这些标记，建立了拟南芥初定位快速图位克隆系统，大大提高了初定位的效率，并实现拟南芥盐敏感突变体S28的快速染色体初定位。