不同海拔高度牛宰后牛肉AMPK活性及能量代谢研究

杨雅媛 宋仁德 韩 玲 高永芳 余群力 马君义

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院， 兰州 730070； 2.青海省玉树州畜牧兽医工作站， 玉树 815000； 3.青海百德投资发展有限公司， 西宁 810008)

0 引言

青海玉树牦牛主要生长在平均海拔4 500 m左右的高山草原，其空气含氧量仅为海平面的50%[1-2]，甘肃甘南牦牛主要分布于海拔3 000 m左右的甘南草原，甘肃张掖地区的西门塔尔牛×秦川牛(西杂牛)主要生活在约1 500 m的农区。本课题组前期研究发现，与低海拔地区的牛肉相比，高海拔地区牛肉中糖酵解强度增加，是由于牦牛为适应高原环境而产生高原适应现象，通过增加糖酵解来维持三磷酸腺苷(ATP)的产生[3-5]。研究表明，牦牛机体中存在适应低氧环境的特有代谢机制，以达到低氧条件下的能量供求平衡，其中5′-一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)作为重要的细胞能量传感器，在调节能量代谢和肉质中起重要作用[6-9]。

低氧条件下，机体处于应激状态，代谢加强，三磷酸腺苷(ATP)消耗增加，ATP的浓度水平降低，AMP生成量增加，高浓度的5′-一磷酸腺苷(5′-AMP)和AMPK的γ-亚基相互作用，激活AMPK[9]。DING等[10]对3种不同海拔高度牦牛中乳酸脱氢酶(LDH)活性研究显示，该酶与海拔高度呈正相关关系，LDH是无氧糖酵解的关键酶，更高海拔的牦牛更加依赖能量代谢供应。LIN等[11]通过对牦牛与平原肉牛背最长肌中LDH活性比较发现，LDH在牦牛中表现出更高的酶活力，与平原肉牛相比，牦牛背最长肌更倾向于糖酵解代谢。SHEN等[12]对3种不同海拔高度猪种糖酵解潜力进行了研究，结果表明，与平原品种相比，较高海拔品种具有较低的能量代谢水平。因此，有必要对不同海拔高度、低氧环境下能量代谢及AMPK活性的变化进行进一步研究。本文研究不同海拔高度牛宰后牛肉成熟过程中AMPK基因(PRKAA1、PRKAA2)mRNA表达量、AMPK活力对糖酵解以及能量代谢的影响，为建立宰后牦牛肉能量代谢理论体系奠定基础。

1 材料仪器与试验方法

1.1 材料与试剂

试验材料：玉树牦牛样本采自青海省玉树藏族自治州(海拔4 500 m左右)，甘南牦牛样本采自甘肃省甘南藏族自治州(海拔3 000 m左右)，西门塔尔杂交牛样本采自甘肃省张掖地区(海拔1 500 m左右)，选取生长发育正常、健康无病、平均年龄2～4岁，体质量(200±20)kg，雌雄各半的3类样本各10头，宰前禁食16～18 h，禁水2 h。屠宰后立即取牛胴体中部背最长肌肉样，置于0～4℃环境下。

试验试剂：RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)，Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RNA逆转录试剂盒)，SYBR Premix Ex TaqTM II(染料法荧光定量试剂盒)，pMD 19-T Vector Kit(逆转录试剂盒)，大连宝生物工程有限公司；RNase-free水， 北京天根生物技术有限责任公司；AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒，康宁生命科学(吴江)有限公司；Trans1-T1感受态细胞，北京全式金生物技术有限公司；牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)酶联免疫检测试剂盒，乳酸测定试剂盒，肌/肝糖原测定试剂盒，游离葡萄糖(Glu)，ATP含量测定试剂盒，ADP含量测定试剂盒，AMP含量测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；Tris-HCl，D-mannitol(D-甘露糖醇)，美国Amresco公司；EDTA，EGTA，美国Sigma公司；DTT，德国Merck公司；NaF(焦磷酸钠)，天津永大化学试剂厂；浓硫酸，NaCl，国药集团化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Eppendorf 5417R型低温台式冷冻离心机，德国Eppendorf生物公司；CFX96型实时定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；BG-power 3500型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽，北京百晶生物技术有限公司；Biometra PCR扩增仪，北京北方华奥贸易有限责任公司；凝胶成像分析系统，美国BIO-RAD公司；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；LRH-250型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；XHF-DY型高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1样品采集和制备

以上述背最长肌(Longissimusdorsi)为试验材料，每头分别取40 g肉样，立即放入液氮中，用于0 h样品，以及AMPK活力、糖酵解指标、能量代谢等指标进行的测定。

将其余背最长肌肉样每块迅速切成40 g，于4℃条件下，分别成熟12、24、72、120、168 h，在相应时间点测定pH值，以及进行AMPK活力、糖酵解指标、能量代谢等指标的测定。同时，将肉样在设计时间点用液氮迅速冷冻，置于-80℃待测。

宰后1 h内取其背最长肌切成约100 mg的小肉块，立即放入无酶无菌冻存管中，液氮中冷冻，置于-80℃，用于对AMPK基因表达量的测定。

1.3.2AMPK活性测定

取样品约0.3 g，按照料液比5 mL/g加入保存于4℃冰箱的冷冻匀浆液，在3 000 r/min的条件下冰浴匀浆，每次匀浆12 s，间隙30 s，连续5次。然后在4℃、10 000 r/min的条件下冷冻离心5 min，取上清液用于AMPK活力的测定。AMPK活力的测定步骤以及计算结果参照试剂盒说明书进行。

1.3.3AMPK基因表达量的测定

总RNA的提取及反转录：参照文献[13]对肌肉中总RNA进行提取。RNA样品于-80℃冰箱中保存。利用反转录试剂盒合成cDNA。按Trizol Reagent试剂盒要求提总RNA；用反转录试剂盒对 RNA 进行反转录[14]。

引物序列来源及合成：PRKAA1、PRKAA2基因引物序列参照马晓冰[15]的设计。

实时定量PCR扩增：本试验按照CFX96型实时荧光定量PCR的二步法进行操作。以所合成的cDNA为模板，使用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒进行实时定量PCR扩增[16]，见表1。

表1 用于实时荧光定量PCR的引物序列及PCR参数Tab.1 Primer sequences and parameter used for real-time quantitative PCR

基因相对表达量的计算：试验采用文献[17]的方法对实时定量PCR数据进行处理和分析，数据用平均值±标准误差表示，均值差异显著性采用One-Way ANOVA统计。采用SPSS 19.0进行相关性分析。

1.3.4糖酵解指标的测定

将pH计的探针插入肉样中，使pH计的电极与肌肉组织充分接触，读数稳定后记录，每个肉样重复测定3次，取平均值。

肌糖原、乳酸、游离葡萄糖含量采用南京建成试剂公司的试剂盒进行测定，试验具体操作和结果计算参照各试剂盒的说明进行。

1.3.5能量代谢指标的测定

参照ATP、ADP、AMP含量测定试剂盒说明书测定其摩尔质量浓度，用双缩脲法测定样品的蛋白含量。

1.4 数据统计分析

试验结果均采用平均值±标准差表示，数据均平行测定3次，用SPSS 19.0软件进行方差分析，用Origin 8.5软件制图。

2 结果与分析

2.1 AMPK活性

AMPK活性会受到运动、缺氧、缺血、应激等多种因素的影响[13，15-16，18]，成熟过程中AMPK活力变化如图1所示，图中小写字母表示同一海拔高度牛肉在成熟过程中指标的差异显著(P<0.05)，大写字母表示不同海拔高度牛肉在每个成熟时间点指标的差异显著(P<0.05)，下同。缺氧条件下，西杂牛AMPK活力均低于甘南牦牛和玉树牦牛，可能是由于牦牛在低氧条件下，机体处于应激状态，代谢加强，ATP消耗增加，ATP的浓度水平降低，AMP生成量增加，高浓度的AMP激活AMPK。AMPK能够调节动物机体糖代谢，当AMPK活化以后可以通过促进糖酵解和糖原分解来提高细胞的ATP水平，抑制糖原合成和糖异生来阻止ATP的消耗[19]，从而增加ATP含量以维持机体能量代谢平衡。

图1 成熟过程中AMPK活力的变化Fig.1 Changes of AMPK activity during conditioning time

2.2 基因表达量

如图2所示，玉树牦牛PRKAA1基因(α1)的表达量与西门塔尔杂交牛和甘南牦牛相比差异不显著，甘南牦牛和玉树牦牛PRKAA2基因(α2)表达量显著大于西门塔尔杂交牛(P<0.05)。AMPK在应激情况下对调节细胞代谢，维持细胞内环境的稳定有重要作用。AMPK α是最为重要的催化亚基，主要分布在骨骼肌、肝脏和心脏，它出现缺陷或活性降低会直接影响机体能量调节功能，α2亚基在骨豁肌中的表达要高于α1亚基，含量占总AMPK的80%以上，并且α2亚基有更强的催化效力[17]。当机体处于代谢应激时，AMPK往往被激活，活化的AMPK能促进外周组织摄取和利用血糖，从而纠正能量代谢的失衡，维护细胞和整体代谢稳态的稳定，因此AMPK α2亚基对宰后糖酵解过程起到主要调节作用。

图2 AMPK α亚基基因表达水平Fig.2 Gene expression of α subnits of AMPK

2.3 宰后糖酵解指标

pH值的下降主要是由屠宰后乳酸的增加引起的[14]。由表2可看出，刚屠宰时，牛肉的pH值均在6.5～7.0之间，屠宰后由于胴体氧气供应中断，糖原进行无氧糖酵解产生乳酸，ATP分解后生成磷酸，乳酸、磷酸使肉的pH值下降。但不同种类的动物肌肉在成熟过程中，pH值下降速度存在差异。玉树牦牛、甘南牦牛和西门塔尔杂交牛成熟至72 h，pH值达到其极限值，此时pH值在5.53～5.58之间。

在3种海拔高度基因型中，背最长肌的糖原和乳酸含量分别如表2所示。成熟过程中糖原含量快速下降，乳酸含量在宰后24 h前迅速增加(P<0.05)，但宰后72 h的变化速率降低，后趋于稳定。玉树牦牛和甘南牦牛是适应低氧水平和寒冷环境的高海拔品种，有特殊的糖酵解特征。为了适应寒冷、高海拔的环境，玉树牦牛和甘南牦牛必须有足够的能量供应来维持体温。无氧代谢(糖酵解)效率低下，每个葡萄糖分子仅产生2个ATP分子，而完全氧化代谢产生38个ATP分子[20]。因此，玉树牦牛和甘南牦牛必须提高能量产生的效率，从而可以诱导高海拔品种增加氧化代谢和减少无氧代谢[21]。影响宰后糖酵解变化的主要因素有糖原含量，糖原影响游离葡萄糖的含量，通过糖酵解将游离葡萄糖分解成乳酸[22]。为了更好地了解糖酵解差异，进一步研究了宰后游离葡萄糖含量(表2)。宰后西杂牛总体游离葡萄糖含量高于玉树牦牛和甘南牦牛。与此同时，宰后成熟过程中游离葡萄糖的含量并没有出现剧烈的上升和下降。根据结果表明，当糖酵解底物含量足够时，糖原合成和分解不是影响乳酸含量进而改变肉质的关键因素，因此该机制解释了不同品种的肉质差异，仅与葡萄糖通过糖酵解分解成乳酸的过程有关。

表2 宰后牛肉成熟过程中糖酵解指标变化Tab.2 Change of yak skeletal muscle quality during conditioning time

随着宰后成熟的进行，ATP逐渐耗尽，肌肉缺少能量控制，肌肉组织开始失控瓦解，解僵开始[23]。在低氧条件下，机体处于应激状态，代谢加强，三磷酸腺苷(ATP)消耗增加，ATP的浓度水平降低，AMP生成量增加，高浓度的5′-AMP和AMPK相互作用，激活AMPK[1,24]。AMPK激活的过程中伴随ADP、AMP含量的降低。如表3所示，不同海拔高度牛肉宰后ADP的消耗总体都呈现显著的下降趋势(P<0.05)，低海拔的西杂牛ADP含量始终较高。

3 结束语

通过测定玉树牦牛(海拔4 500 m)、甘南牦牛(海拔3 000 m)和西门塔尔杂交肉牛(海拔1 500 m)宰后成熟过程中牛肉AMPK活性、AMPK基因(PRKAA1、PRKAA2)mRNA表达量、糖酵解和能量代谢的变化可以得出，高海拔地区AMPK的活性高于低海拔地区，并且高海拔地区条件下PRKAA1和PRKAA2基因表达量均高于低海拔条件下。这说明PRKAA1以及PRKAA2基因表达量升高会使AMPK的活性增加，AMPK被激活后直接磷酸化糖酵解通路，使糖酵解活性增加，从而促进糖酵解进程，产生大量乳酸，进而导致宰后动物肌肉的能量代谢降低。因此，高海拔、低氧适应性下牛肉AMPK的活性增加，从而加快糖酵解代谢，有效调节能量的生成，为建立宰后牦牛肉能量代谢理论体系奠定了一定基础。

表3 宰后牛肉成熟过程中能量代谢指标变化Tab.3 Change of yak skeletal muscle energy metabolism during conditioning time mmol/g