CaCl2对纤维核诱导乳清浓缩蛋白聚合能力的影响

徐红华 谢明明 丁 瑞 马金玉 高子雯 关 琛

(东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030)

0 引言

乳清浓缩蛋白(WPC)在特殊条件下可以自组装形成纤维状聚合物[1-3]。由于乳蛋白纳米纤维具有特殊的功能性质(如凝胶性[4]、增稠特性[5]、稳定的乳化性[6-7]与泡沫稳定性[8])，近年来在食品行业中应用广泛。这种纤维状聚合物的形成过程可分为滞后期、生长期和稳定期[9]。纤维形成机理主要为二次成核理论，即初级成核与二次成核。初级成核是在滞后期蛋白质单体发生聚合形成稳定的均相核结构，均相核具有在纤维形成过程中最高的自由能；二次成核是指单体在均相核的表面有序排列，从而形成成熟纤维的过程[10-14]。研究发现在乳清分离蛋白形成纤维过程中加入二次核(成熟纤维)，滞后期时间缩短，加速纤维的形成[15]，均相核诱导蛋白形成纤维的研究报道较少。Ca2+会影响蛋白质纤维自发形成的聚合结构，LOVEDAY等[16-17]研究发现β-乳球蛋白在形成纤维过程中添加一定的CaCl2，会促进纤维的形成，缩短滞后时间，但纤维的形态发生了变化，由长、细、半柔性变为短小、弯曲。但是，目前的研究主要集中在CaCl2对WPC自发形成纤维的影响方面，鲜有核诱导方面的报道。本文通过比较添加CaCl2与未添加CaCl2对WPC自发形成的纤维以及均相核/二次核诱导WPC在聚合过程中硬度、黏度以及聚合率的差异，探讨CaCl2对核诱导WPC聚合能力的影响，以期为改善乳清浓缩蛋白的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1主要材料

乳清浓缩蛋白WPC-80，美国HILMAR公司；CaCl2，纯度99.99%，阿拉丁公司；硫黄素 T，Sigma公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.1.2主要仪器

CP153型电子精密天平，奥豪斯仪器有限公司；DELTA320型pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；3-18K型离心机，Sigma公司；KDN-102C型半自动定氮仪，上海纤检仪器有限公司；HHW型数显恒温水浴锅，常州丹瑞实验仪器有限公司；旋转流变仪，英国马尔文公司；TA-XT2 PLUS型物性测定仪，英国STABLE MICRO SYSTEM公司；JEM-1200EX型透射电子显微镜，日本日立公司；F-4500型荧光分光光度计，日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1样品的制备

乳清浓缩蛋白自发形成纤维加钙(WPC自发+钙)：参照LOVEDAY等[18]的方法略有改动，将5.00 g WPC溶于去离子水中，用6 mol/L HCl调pH值为2.0，定容至100 mL。19 000g、4℃下离心20 min，取中层清液，利用凯氏定氮法测定蛋白质含量，用pH值2.0的去离子水(6 mol/L HCl调去离子水至pH值2.0)稀释至3.0%。添加0.75 mol/L的CaCl2溶液，蛋白质量分数为2.8%，CaCl2终浓度为50 mmol/L。90℃水浴加热，并于4℃冰箱保存。

乳清浓缩蛋白自发形成纤维(WPC自发)：上述3.0%蛋白溶液，添加与CaCl2相同体积的pH值2.0去离子水，蛋白质量分数为2.8%。90℃水浴加热，并于4℃冰箱保存。

均相核诱导乳清浓缩蛋白形成纤维加钙(均相核诱导WPC+钙)：3.0%的WPC，90℃下加热2 h形成均相核[19-20]。均相核与3.0% WPC溶液以质量比1∶3混匀，蛋白质量分数为3.0%(pH值2.0)。添加0.75mol/L的CaCl2溶液，蛋白质量分数为2.8%，CaCl2终浓度为50 mmol/L。90℃水浴加热，并于4℃冰箱保存。

均相核诱导乳清浓缩蛋白形成纤维(均相核诱导WPC)：3.0%的均相核WPC混合液，添加与CaCl2相同体积的pH值2.0去离子水，蛋白质量分数为2.8%。90℃水浴加热，并于4℃冰箱保存。

二次核诱导乳清浓缩蛋白形成纤维加钙(二次核诱导WPC+钙)：3.0%的WPC，90℃下加热10 h形成成熟纤维即二次核。二次核与3.0% WPC溶液以质量比1∶3混匀，蛋白质量分数为3.0%(pH值2.0)。添加0.75 mol/L的CaCl2溶液，蛋白质量分数为2.8%，CaCl2终浓度为50 mmol/L。90℃水浴加热，并于4℃冰箱保存。

二次核诱导乳清浓缩蛋白形成纤维(二次核诱导WPC)：3.0%的二次核WPC混合液，添加与CaCl2相同体积的pH值2.0去离子水，蛋白质量分数为2.8%。90℃水浴加热，并于4℃冰箱保存。

1.2.2质构特性

将pH值2.0的3.0% WPC、均相核、二次核与11.0% pH值2.0的WPC溶液以体积比1∶1混匀，使其蛋白质量分数为7.0%。混合溶液加入0.75 mol/L CaCl2，蛋白质量分数为6.53%，CaCl2终浓度为50 mmol/L，于烧杯中90℃水浴加热5 h。对照样为蛋白质量分数7.0%的混合液，加入与CaCl2相同体积的pH值2.0去离子水,蛋白质量分数为6.53%。放置4℃冰箱12 h，次日取出恢复至室温(20℃)。采用质构剖面分析方法(Texture profile analyse, TPA)测定样品的硬度、胶粘性指数、弹性指数以及咀嚼性指数，参数设定为：测试前速度1 mm/s，测试速度1.7 mm/s，测试后速度2 mm/s，下压距离10 mm，引发力5 N，探头型号A-BE-D35[21]。

加钙样品较对照样硬度增加量为

N=NCa-N0

(1)

式中N——硬度增加量，g

NCa——加钙样品硬度，g

N0——对照样硬度，g

加钙样品较对照样胶粘性指数增加量为

A=ACa-A0

(2)

式中A——胶粘性指数增加量

ACa——加钙样品胶粘性指数

A0——对照样胶粘性指数

1.2.3表观黏度

1.2.1节中的样品于90℃水浴加热0、1、2、3、4、5、7、10 h，使用旋转流变仪测定样品的黏度。选择直径60 mm的平行板，板间距150 nm，剪切速率变化范围为0.01～100 s-1，用一次性胶头滴管吸取2 mL溶液，使样品均匀分布于底部平板上[22],在剪切速率为10 s-1时取值。

加钙样品较对照样黏度的增加量为

B=BCa-B0

(3)

式中B——加热10 h的黏度增加量，Pa·s

BCa——加钙样品在加热10 h的黏度，Pa·s

B0——对照样在加热10 h的黏度，Pa·s

1.2.4蛋白聚合率

1.2.1节中的样品于90℃水浴加热0、2、5 h，取20 mL样液于50 mL离心管中，15 000g、4℃离心30 min，取上层清液，利用凯氏定氮法测定蛋白含量，计算公式为

C=1-Ct/CWPC0h

(4)

式中C——蛋白聚合率

CWPC0h——WPC自发加热0 h的蛋白质量浓度，mg/mL

Ct——样品加热t时的蛋白质量浓度，mg/mL

1.2.5Th T荧光分析

1.2.1节中的样品于90℃水浴加热，每隔1 h取样(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)。用含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸缓冲液(pH值7.0)配制800 mg/L的甲硫磺素T(Th T)的溶液。用水系0.22 μm滤膜过滤，滤液即为Th T储备液。放置于棕色瓶中并于4℃冰箱避光保存。测定时将Th T储备液用含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸缓冲液(pH值7.0)稀释50倍，得到Th T工作液；取800 μL样品加入10 mL的Th T工作液中，旋涡震荡1 min后，于荧光分光光度计下比色。设定参数为：激发波长460 nm，发射波长490 nm，狭缝宽度5 nm和10 nm，测定不同加热时间下样品的荧光强度[23]。

1.2.6透射电镜

1.2.1节中的样品于90℃下加热5 h，在4℃冰箱中保存12 h，取出后放至室温。用超纯水将样品稀释至1 mg/mL，取稀释液滴于透射电镜专用铜网上吸附20 min，用滤纸吸除多余液体，在室温下干燥10 min，在80 kV电压下观察样品的微观结构[24]。

1.2.7数据处理分析

试验数据采用SigmaPlot 10进行制图和IBM SPSS Statistics v 20.0软件对试验数据进行ANOVA方差分析，检验差异显著性(P<0.05)。数据均以平均值±标准差表示(n=3)。

2 结果与讨论

2.1 凝胶质构特性

结果如表1所示，未加钙样品其硬度与胶粘性均为核诱导WPC高于其自发聚合，并且二次核诱导略高于均相核诱导。CaCl2的加入可以明显改善WPC样品的凝胶质构，但核诱导的提高幅度更大，从CaCl2添加前后WPC凝胶硬度的提升差值可以看出(图1)，核诱导WPC分别是其自发聚合的1.661倍(均相核诱导)和1.821倍(二次核诱导)；胶粘性提升量分别是其自发聚合的2.544倍(均相核诱导)和2.129倍(二次核诱导)。上述结果可以发现，相对WPC自发聚合，CaCl2的加入对核诱导WPC聚合的影响更大。

表1 凝胶质构特性Tab.1 Textural properties of different samples

注：同行不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.2 表观黏度

纤维形成过程中Ca2+的影响也存在很大差异，Ca2+在自发与核诱导2种不同形成方式中的作用也有很大不同。在形成过程中，黏度均呈上升趋势。核诱导WPC形成的纤维聚合物其黏度高于WPC自发聚合，同时，添加CaCl2的样品其黏度较对应的未添加CaCl2样品均有升高，在前2 h的滞后期差异不大，随着热聚合的持续，Ca2+的影响程度增大(图2a)；在形成方式中，Ca2+在自发与核诱导中的作用有很大不同，添加CaCl2后对核诱导聚合的改善幅度更大，均相核诱导WPC与二次核诱导WPC其黏度增加量分别是WPC自发黏度增加量的2.261与2.479倍(图2b)。

图1 WPC自发、均相核诱导WPC、二次核诱导WPC添加CaCl2后纤维凝胶硬度与胶粘性的变化Fig.1 Changes of hardness and gumminess by adding CaCl2 to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

图2 WPC自发、均相核诱导WPC、二次核诱导WPC添加CaCl2后形成纤维的黏度变化Fig.2 Changes of viscosity by adding CaCl2 to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

表明CaCl2的加入对核诱导WPC热聚合的提高幅度更大。

2.3 蛋白聚合率

通过聚合率可从侧面研究蛋白质的聚合能力。由图3可知，随着加热时间延长，不同样品的聚合率均有上升，这表明延长热处理时间会促进蛋白质之间聚合形成大分子聚合物。且核诱导WPC形成的蛋白聚合率高于WPC自发聚合。样品添加CaCl2后其聚合率明显提高，但是，在纤维形成的不同时期Ca2+的影响程度不同，未经过热处理(0 h)Ca2+的混入就可以提高聚合程度；随着热处理的进行，在纤维形成滞后期(2 h)Ca2+的混入可以较大幅度提高其聚合程度；生长期(5 h)Ca2+的影响程度降低，聚合率差值减小。

图3 WPC自发、均相核诱导WPC、二次核诱导WPC添加CaCl2后形成的纤维在热处理过程中聚合率的变化Fig.3 Changes of polymerization by adding CaCl2to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

2.4 透射电镜

通过透射电镜观察添加CaCl2对纤维微观形态的影响。CaCl2的加入明显改变纤维的形态，由细长半柔性的纤维(图4a、4b、4c)变为短小弯曲团簇聚集状(图4d、4e、4f)，表明添加50 mmol/L CaCl2对WPC的聚合有促进作用。核诱导形成的纤维数量较WPC自发形成的纤维多。对于自发与核诱导两种纤维形成方式，加钙WPC自发是独立的纤维团簇聚集体而核诱导则是纤维团簇聚集体之间相连，CaCl2对核诱导形成的纤维聚合影响更大。

图4 WPC自发、均相核、二次核诱导WPC添加CaCl2后加热5 h形成的纤维透射电镜图Fig.4 Transmission electron micrographs of different samples heated for 5 h at 90℃ and pH value of 2.0

2.5 Th T荧光分析

Th T是一种荧光染料，可以与纤维的β-折叠结合，间接反映纤维的产量[8]。均相核与二次核诱导WPC形成的纤维其荧光强度较WPC自发聚合高(图5)，表明核诱导较WPC自发形成纤维数量多。混入Ca2+后在纤维形成的不同时期存在不同程度的影响。在滞后期(0～2 h)添加CaCl2的WPC自发与均相核诱导较对照样荧光强度高，表明CaCl2在其滞后期促进纤维的形成，但在生长期与稳定期荧光强度较对照样低。二次核诱导WPC在加热0～1 h，添加CaCl2的样品与对照样其荧光强度相近，从2 h开始，添加CaCl2的二次核诱导WPC其荧光强度较对照样低。由此可推测，CaCl2并没有影响纤维核结构的形成，但会促进随后的聚合。纤维聚合在一起，Th T无法充分地与聚合纤维结合[25]，从而影响了荧光强度的结果。

图5 WPC自发、均相核诱导WPC、二次核诱导WPC添加CaCl2后热处理过程中Th T荧光强度的变化Fig.5 Changes of Th T fluorescence intensity by adding CaCl2 to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

3 结论

(1)CaCl2会提高纤维体系的黏度、硬度与聚合率，并且CaCl2对核诱导形成的纤维影响更大。

(2)CaCl2的加入对纤维的形态有影响，使纤维由细长直链变为弯曲聚集的状态，促进纤维之间的聚合，并且对核诱导的纤维影响更大。

(3)在加热初期，添加CaCl2对WPC自发与均相核诱导WPC形成纤维有促进作用。在加热后期，加钙样品的荧光强度较未加钙样品低。