三步止泻法推拿调节脾虚乳兔脑—肠轴的HE实验研究

杨丽秋 龙鑫 夏惠明 汪昂 岳阳 杨阳

【摘 要】目的：研究三步止泻法推拿调节脾虚乳兔脑-肠轴的组织病理变化。方法：将乳兔制成脾虚模型后，分成手法组、对照组、空白组。手法组予三步止泻手法干预脾虚模型乳兔，对脑、胃、肠组织进行形态病理检测。结果：手法组与对照组比较，肠组织HE实验形态有明显变化，脑、胃的组织HE实验形态未见明显变化。结论：证明三步止泻法治疗脾虚乳兔模型后，证明三步止泻法治疗小儿腹泻对肠组织的影响较大，对脑及胃的组织影响不大，明确手法与脑-肠轴有强相关性。

【关键词】三步止泻法；脾虚乳兔；脑-肠轴；HE实验

【中图分类号】R249 【文献标志码】B 【文章编号】1005-0019（2018）08-124-01

“三步止泻手法”是云南省推拿科治疗腹泻的特效疗法，三法是补脾，摩腹，推上七节骨。

相关研究表明脑-肠轴系统的改变与小儿腹泻的发病密切相关。脑-肠轴是联系认知感情中枢与神经内分泌、肠神经系统和免疫系统的双向交通通路。脑肠轴为连接中枢神经系统（CNS）与胃肠道的神经一内分泌双向通路[1]。本课题研究三步止泻手法组治疗脾虚乳兔模型后，对脑、胃、肠组织形态检测。取实验乳兔脑浆、胃内壁、回肠远端肠管长约20cm，清除内容物，甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，脱蜡后滴加抗体。染色显色水洗复染，封片。统计分析，证明三步止泻法治疗脾虚乳兔模型后，证明三步止泻法治疗小儿腹泻对肠组织的影响较大，对脑及胃的组织影响不大，明确手法与脑-肠轴有强相关性。

1 HE实验方法

1.1 主要实验设备 TGL-16B型台式离心机荧光，隔水式电热37℃恒温培养箱，高速冷冻离心机、石蜡切片机，电热恒温水浴锅，快速混匀器，数码成像及分析系统等。

1.2 主要实验试剂 氯化钠（NaCl）、多聚甲醛、二甲苯、中性树胶、脱钙液、甲苯胺蓝、固绿。

1.3 实验动物 取日本大耳乳兔36只，雌雄各半，体重500-600g。动物实验饲养环境：室温，自然光照，自由饮水，喂养标准饲料（云南中医学院实验动物中心提供）。出生3-4周龄左右的健康乳兔l0只，雄性，体重500-600。随机分为3组。

1.4 实验手法分组 手法组10只，对照组10只，空白模型组10只。手法治疗组以治疗兔，专人操作，手法、操作步骤及时间固定。操作如下：脾穴位：乳兔拇指螺纹面（旋推法），摩腹取穴乳兔整个腹部。乳兔尾骨至骶1椎骨一条线，方向为从尾骨到骶骨（直推法），每天1次，连续1周。对照组乳兔予喂服斯密达药物；空白组为模型制作后不予任何治疗，予饲料喂养。

1.5 脾虚证动物模型制作 采用通过喂服生大黄粉（与饲料拌食）方式，连续灌服14天，每天3次，出现7天以上，腹泻症状，大便形状改变，体重下降等脾虚症状即模型制作成功。

1.6 实验步骤

1.6.1 取材与固定 从动物新鲜尸体上取下组织块投入预先配好的固定液中（使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

1.6.2 脱水透明 用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精。

1.6.3 浸蜡包埋 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。

1.6.4 切片与贴片 将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

1.6.5 脱蜡染色 染色前，用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，后染色。过程：

①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。

②酸水及氨水中分色，各数秒钟。

③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。

④入70%和90%酒精中脱水各10分钟。

⑤入酒精甲苯胺蓝、固绿、染色液染色2～3分钟。

1.6.6 脱水透明 染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。

1.6.7 封固 切片滴上加拿大树胶，盖玻片封固。树胶略干后，贴上标笺待用。

1.7 统计处理 数据以均数±标准差（x±s）表示，计量资料用t检验，计数资料用卡方检验，所有数据均在统计学分析软件SPSSl7进行处理。P<0.05有统计学意义。

2 结果

空白组：镜下可见肠粘膜向肠腔突起形成绒毛，肠上皮细胞排列较规则，肠粘膜上皮细胞偶见脱落，血管偶见少量充血；

對照组：镜下可见小肠粘膜上皮细胞水肿，出血，肠绒毛上皮细胞排列紊乱，肠绒毛结构破坏明显，上皮细胞大量脱落坏死，肠粘膜上皮血管大量扩张、充血。粘膜下层血管充血明显。

手法组：镜下可见肠粘膜上皮细胞脱落较对照组明显减轻，且肠粘膜上皮细胞排列较对照肠整齐，血管充血减轻。

脑组织，胃组织三组对比均无明显变化。

肠组织手法组与对照组比较P<0.05 。

3 讨论

“三步止泻手法”简便易于操作，无副作用，可以广泛推广，治疗疗程短，花费少，该绿色疗法可在小儿身体保健治疗方面有很重要的应用前景。

通过该项研究，证明三步止泻法治疗脾虚乳兔模型后，脑胃组织形态HE染色后未见明显变化，对照组中肠组织经HE染色后镜下可见小肠粘膜上皮细胞水肿，出血，肠绒毛上皮细胞排列紊乱，肠绒毛结构破坏明显，上皮细胞大量脱落坏死，肠粘膜上皮血管大量扩张、充血。粘膜下层血管充血明显。手法组中组织经HE染色后镜下可见肠粘膜上皮细胞脱落较对照组明显减轻，且肠粘膜上皮细胞排列较对照肠整齐，血管充血减轻。证明了三步止泻作用于脾虚乳兔后肠道后可明显恢复肠道的功能，同时明确三步止泻法治疗小儿腹泻与脑肠轴作用机制的强相关性。

参考文献

[1] 贺利平毛华，脑肠肽在功能性消化不良中的研究进展，国际消化病杂志，2013，10（33）：315-317