高效抑制大肠埃希氏菌的芽孢杆菌的 发酵培养基及发酵条件优化

张子豪,康建依,谢远红,易欣欣,刘 慧,侯 爽,马 祎,高秀芝

(北京农学院食品科学与工程学院,食品质量与安全北京实验室,农产品有害微生物 及农残安全检测与控制北京市重点实验室,微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,北京 102206)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)是人和动物肠道的正常寄居菌,但大肠埃希氏菌极易造成食品的污染[1-3],从而能够引起人和动物的疾病,同时,由大肠杆菌 O157感染致病的病例于1982年在美国首次出现[4],随后于世界各国迅速传播与扩散,是危害严重的肠胃疾病之一,近年来,集约化养殖场其他主要疾病已得到基本控制,但大肠杆菌病有明显的上升趋势,已成为养禽业主要的细菌疾病之一[5]。我国各个省份肉制品中检查出相关大肠杆菌的现象时有发生[6],如史秋梅等[7],检测了河北省内不同地区的生活用肉、蛋类等105个样品,检测到大肠杆菌19株,大肠杆菌阳性检出率为18.1%。陈玲等[8]检测200份江苏地区食品样品,大肠杆菌0157的分离率1.5%。

目前由于抗生素广泛使用,大肠杆菌对各种抗生素耐药性已经到了很严重的地步[9-10],故需求一种安全可靠、能够代替抗生素的无残留的替代品。研究发现芽孢杆菌能产生多种抗菌代谢产物,被认为能有效防治植物病害,抑制多种病原性微生物[11-14],芽孢杆菌发酵简便,抑菌蛋白性质稳定,水溶性较好,适合应用于微生物制剂[15]。近年来学者在解淀粉芽孢杆菌的新发现与发酵条件的优化方面进行了大量探索[16-18],致力于将其代谢产物应用于果蔬与冷却肉的保鲜研究中[19-21],如:孔维佳等[22]研究发现一株解淀粉芽孢杆菌代谢产物对扩展青霉有强拮抗作用,可用于果蔬采后青霉病的抑制剂。时威等[23]研究发现，解淀粉芽孢杆菌发酵液处理组可将冷却肉的保质期延长6～9 d,而且效果优于Nisin。

本试验以大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)为指示菌,从校园土壤中筛选出具有抑菌效果的芽孢杆菌,对其进行菌种鉴定,采用单因素与正交试验,对发酵培养基及发酵条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC 11775 中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏菌株;菌株G3E 分离自北京农学院校园土壤;营养肉汤(nutrient broth,NB)培养基、营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基 北京陆桥;功能菌发酵培养基:淀粉10 g/L、氯化钙4 g/L、酵母浸出物4 g/L、胰蛋白胨4 g/L、尿素2 g/L;氯化钠 分析纯,北京化工厂;葡萄糖 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;麦芽糖、可溶性淀粉(以下简称淀粉) 分析纯,奥博星生物技术公司;尿素 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;胰蛋白胨、酵母浸出物 生物试剂,奥博星生物技术公司;硫酸镁 分析纯，西陇化工厂;氯化钙 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

PHS-3B型酸度计 上海雷磁仪器厂;TG16-WS高速台式离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;牛津杯(内径(6±0.1) mm,外径(7.8±0.1) mm) 北京先驱威锋技术开发公司;0.25 μm无菌滤器 德国Merck MiLLipore集团;DHZ-C1全温振荡器 太仓市试验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 大肠埃希氏菌指示平板的制备 用接种环挑取大肠埃希氏菌一环，接种于50 mL营养肉汤中,37 ℃、150 r/min摇床培养18～24 h,取1 mL菌液梯度稀释于9 mL生理盐水中,测定其菌落总数,使菌液浓度为108CFU/mL。取0.2 mL菌液于200 mL冷却未凝固的营养琼脂中混匀,倒平板待用。

1.2.6.4 功能菌发酵培养基正交优化实验 以淀粉添加量、酵母浸出物∶胰蛋白胨∶尿素添加量(2∶2∶1)及氯化钙添加量为因子,抑菌圈直径为指标,进行L16(43)正交实验,因素水平表见表1。

1.2.2.3 复筛及菌种鉴定 以得到的对大肠埃希氏菌有明显抑制作用的菌株G3E为功能菌株,进行功能菌发酵粗提液制备及抑菌效果测定实验,进一步确认其抑菌活性,并送中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定。

选择我院中2016年2月至2016年9月中收治得得手术患者100例作为研究对象,按照患者的入院顺序将其分为对照组和实验组,两组中均包含50例患者。对照组中包括男性患者21例,女性患者29例,患者年龄为45—68岁,平均年龄为(57.4±3.9)岁;实验组中包括男性患者26例,女性患者24例,患者年龄为41—65岁,平均年龄为(54.7±4.9)岁。两组患者均进行常规手术,术后进行护理,无相关手术禁忌症和其他器质性疾病。两组患者在一般资料上无统计学意义,具有可比性。

1.2.2.2 对大肠埃希氏菌具有抑菌活性的芽孢杆菌的初筛 以接种环点接种各株芽孢杆菌至大肠埃希氏指示平板表面,37 ℃培养24 h,记录并保存活性菌株。

1.2.2.1 芽孢杆菌初筛 取校园不同区域土样5份,称取各土壤样品10 g于90 mL无菌生理盐水,200 r/min振荡5 min,80 ℃水浴30 min[24],制成1∶10的土壤稀释液,取1 mL涂布于NA平板,37 ℃培养24～48 h,选取具有单菌落的平板,挑取单菌落2次划线并编号，接种至NA平板继续培养24 h,将镜检后产芽孢的菌株保藏备用[25]。实验室菌库芽孢杆菌15株(来源于发酵豆酱)活化备用。

2）部分品种抗倒性不强。小麦品种之间抗倒性差异明显，种植了抗倒性差的品种，会加大倒伏发生的风险［7］。

1.2.2 抑制大肠埃希氏菌的芽孢杆菌筛选

1.2.3 功能菌发酵粗提液制备实验 将筛选所得菌体G3E以接种环划线至营养琼脂平板培养12 h,于此平板中取一环接入50 mL营养肉汤中,35 ℃,150 r/min培养12 h作为种子液,以2%的接种量将种子液接入50 mL营养肉汤中,35 ℃,150 r/min培养24 h[26],4 ℃、4000 r/min离心20 min,取上清液过0.22 μm滤膜,备用。

期刊评级主要是通过引文数据库，期刊前几年发表的文献在统计当年被引用次数除以该刊前几年发表的文献数（有些会包含新闻等，有些不含）。

“君子怀德”，儒家传统文化以“君子”命名具备高尚道德节操的贤哲志士：“所谓君子者，躬行忠信，其心不买； 仁义在己，而不害不志； 闻志广博，而色不伐； 思虑明达，而辞不争； 君子犹然如将可及也，而不可及也。 如此，可谓君子矣。”(《大戴礼记·哀公问五义》)儒家君子理想境界所展现的精神实质，强调具有自强不息的独立人格品质，奋发坦荡的无畏开拓意志，以及为国家、民族与理想忠诚奋斗的奉献精神。 在儒家文化浸染下，朱熹在《王梅溪文集序》对君子人格形象进行了论述：

1.2.6 功能菌发酵培养基的优化

1.2.5 功能菌发酵实验最佳接种量试验 将功能菌分别以1%、2%、5%和8%[35]的接种量进行功能菌发酵粗提液制备实验,并设置三组平行实验,以所得功能菌发酵粗提液进行抑菌效果测定实验。

1.2.4 抑菌效果测定实验 将牛津杯放置于大肠埃希氏菌指示平板表面,向其中加入0.2 mL功能菌发酵粗提液,37 ℃培养24 h,测量其抑菌圈直径。

1.2.6.1 碳源单因素实验 固定功能菌发酵培养基氮源为酵母浸出物10 g/L,无机盐为氯化钙4 g/L,分别考察以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖及淀粉各10 g/L为碳源时抑菌圈直径的大小。

1.2.6.2 氮源单因素实验 固定功能菌发酵培养基碳源为淀粉10 g/L,无机盐为氯化钙4 g/L,考察分别以酵母浸出物、牛肉膏、酵母浸出物∶胰蛋白胨(1∶1)、酵母浸出物∶胰蛋白胨∶尿素(2∶2∶1)、酵母浸出物∶胰蛋白胨∶氯化铵(2∶2∶1)、尿素及氯化铵各10 g/L为氮源时抑菌圈直径的大小。

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1.2.6.3 无机盐单因素实验 固定功能菌发酵培养基碳源为淀粉10 g/L,氮源为酵母浸出物∶胰蛋白胨∶尿素(2∶2∶1)10 g/L,考察分别以硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钠、氯化钙及硫酸锰各4 g/L为无机盐时抑菌圈直径的大小[27]。

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表1 发酵培养基正交试验因素水平表Table 1 Factors levels of fermentation medium orthogonal experiment

1.2.7 功能菌发酵条件的优化 以培养温度、培养时间及培养基pH为因子,结合解淀粉芽孢杆菌培养条件相关研究[28-31],选取正交因子水平范围,以抑菌圈直径为指标,进行L16(43)正交实验,因素水平表见表2。

3)直流侧单极故障时高接地阻值有利于故障穿越及系统恢复，直流电压不平衡保护作为该类故障的主保护并动作于报警，系统可带故障运行；由故障选线定位策略实现该故障类型的隔离。

表2 发酵条件正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of culture condition orthogonal experiment

1.3 数据处理

利用Excel 2007和SPSS 18分析软件对数据进行统计分析,并结合Duncan氏法做多重比较,所有实验均重复三次,结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 功能菌筛选与鉴定

经过初筛、复筛及大肠埃希氏菌抑菌效果验证试验,得到2株对大肠埃希氏菌有明显抑制作用的菌体,选取抑菌效果最好的芽孢杆菌G3E作为功能菌株,其在大肠埃希氏菌指示平板上抑菌圈可达到15.0 mm。根据菌种的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析,经鉴定G3E菌种为解淀粉芽孢杆菌植物亚种Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum(同种异名:贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis),NCBI登录号为:KY621478.1。

2.2 不同接种量对解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌效果的影响

不同接种量对解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌效果的影响结果如图1所示,当接种量为2%时,发酵上清液的抑菌活性最高,抑菌圈直径达到(17.2±0.10) mm,确定2%为最佳接种量。

图1 接种量对解淀粉芽孢杆菌G3E的抑菌效果的影响Fig.1 Effect of different inoculation amount on Bacillus amyloliquefaciens G3E antibacterial activity注:字母不同表示差异显著(p<0.05);图2～图4同。

2.3 解淀粉芽孢杆菌G3E发酵培养基优化试验

2.3.1 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌效果的影响 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌G3E活性影响如图2所示,麦芽糖与其它碳源有显著性差异(p<0.05),其它三种碳源对抑菌活性物质表达的影响差异不显著。碳源为淀粉时,发酵上清液抑菌活性最大,其抑菌圈直径达到(16.7±0.30) mm。结合赵延存等[32]的研究结果,选择淀粉为解淀粉芽孢杆菌G3E发酵培养基的最佳碳源。

图2 碳源种类对解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌活性的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on Bacillus amyloliquefaciens G3E antibacterial activity

2.3.2 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌效果的影响 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌活性的影响如图3所示,氮源的改变对抑菌活性影响显著(p<0.05),当氮源为6号与7号时,抑菌活性消失,3号与其它氮源有显著性差异(p<0.05),发酵上清液抑菌活性较低。以4号氮源进行发酵培养时,发酵上清液抑菌活性最大,优于其它6种氮源,其抑菌圈直径达到(18±0.10) mm,故选择4号,即酵母浸出物∶胰蛋白胨∶尿素(2∶2∶1)为解淀粉芽孢杆菌G3E发酵培养基的最佳氮源。

图3 氮源种类对解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌活性的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on Bacillus amyloliquefaciens G3E antibacterial activity

2.3.3 不同无机盐对解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌效果的影响 不同无机盐对解淀粉芽孢杆菌抑菌活性的影响如图4所示,无机盐的改变对抑菌活性影响显著(p<0.05),当无机盐为硫酸锰时,抑菌活性消失。其它四种无机盐相互之间差异显著(p<0.05),当无机盐为氯化钙时,发酵上清液抑菌活性最大,其抑菌圈直径达到(20±0.10) mm,故选择氯化钙作为解淀粉芽孢杆菌G3E发酵培养基无机盐。有研究表明,钙离子可提高细菌发酵产物产量,提高其催化及代谢功能,增强抑菌活性,与本文结果一致[33]。

图4 无机盐种类对解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌活性的影响Fig.4 Effects of different inorganic salts on Bacillus amyloliquefaciens G3E antibacterial activity

2.3.4 发酵培养基正交优化实验 解淀粉芽孢杆菌G3E发酵培养基正交优化试验结果如表3所示,从抑菌圈直径指标来看,影响抑菌活性的影响因素顺序为:碳源>氮源>无机盐,抑菌能力表达最佳发酵培养基为A2B2C2,即碳源10 g/L、氮源10 g/L、无机盐4 g/L。

表3 发酵培养基 L16(43)正交试验设计及结果Table 3 L16(43)orthogonal array design and results of fermentation medium

优化解淀粉芽孢杆菌发酵培养基可有效提高抑菌活性物质的产量及防效[34]。以淀粉10 g/L、氯化钙4 g/L、酵母浸出物4 g/L、胰蛋白胨4 g/L、尿素2 g/L为发酵培养基，进行抑菌效果验证试验,所得抑菌圈平均直径为(22.5±0.50) mm,此时解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌物质表达能力优于培养基正交试验中各试验组。

2.4 解淀粉芽孢杆菌G3E发酵条件正交试验

解淀粉芽孢杆菌G3E抑菌物质发酵条件正交优化试验结果如表4所示,从抑菌圈直径指标来看,影响抑菌活性的影响因素顺序为:培养温度>培养时间>pH,抑菌能力表达最优发酵条件为A4B4C1,即40 ℃、40 h、pH7.0,恰为正交试验第16组,此时解淀粉芽孢杆菌G3E发酵上清液抑菌圈直径为可达(23.6±0.4) mm。显著大于以普通细菌发酵条件(35 ℃、24 h、pH7.0[35])的(15.0±0.3) mm(p<0.05)。

表4 发酵条件L16(43)正交试验设计及结果Table 4 L16(43)orthogonal array design and results of fermentation conditions

3 结论

本研究从土壤中筛选对大肠埃希氏菌具有高抑菌活性的芽孢杆菌,采用单因素与正交试验,对发酵培养基及发酵条件进行优化,解淀粉芽孢杆菌植物亚种G3E发酵培养基正交实验表明,影响抑菌活性的因素顺序为:碳源>氮源>无机盐,最佳发酵培养基为淀粉10 g/L、氯化钙4 g/L、酵母浸出物4 g/L、胰蛋白胨4 g/L、尿素2 g/L。

解淀粉芽孢杆菌植物亚种G3E发酵条件正交实验表明,影响抑菌活性的因素顺序为:培养温度>培养时间>pH,最佳发酵条件为40 ℃、40 h、pH7.0,以2%接种量进行菌体发酵,发酵液上清的抑菌圈直径可以达到(25.5±0.5) mm。