黑米色素提取工艺优化及其稳定性

张素敏,李俊伟,李俊瑞,王丽莎,朱俊玲,3,*

(1.山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷 030801; 2.太谷县鑫炳记食业有限公司,山西太谷 030801; 3.山西功能食品研究院,山西太谷 030801)

黑米种植历史悠久,是中国古老而名贵的药食兼用的特殊稻种。黑米营养丰富,主要含有蛋白质、碳水化合物两类营养物质,富含钙、磷、钾、镁、铁、锌等矿物元素以及B族维生素、维生素E[1]。此外,黑米具有特殊的药用价值,能够改善缺铁性贫血、降血压、活血名目、健脾暖胃,享有“药米”、“世界米中之王”的美誉。食用天然色素按照来源可以分为植物源的天然色素,动物源的天然色素、微生物源的天然色素3类[2]。目前,我国研究和应用最多的是以植物资源为原料,应用提取、分离、浓缩等技术而获得的多功能天然植物色素。与合成色素相比,天然色素具有色调自然,易于吸收,对人体的安全性高的优点[3]。

黑米中含有丰富的色素,属于天然的花青素类色素,具有抗氧化和消除自由基的功效,有一定的药用及保健价值[4]。目前国内外对黑米的研究,主要是将其作为原料生产成产品,比如一些复合饮料、复合乳、饼干等[5-6],对黑米中活性物质的提取也有些研究,例如王磊等[7]利用超声波辅助醇提法提取了黑米中的黄酮,并对工艺进行了优化。于长顺等[8]用酸化水基萃取剂提取黑米色素,并用大孔树脂对其进行精制。邓文辉等[9]对黑米色素抗疲劳的生化机理研究做了展望，但是大部分提取都是以正交试验进行优化,且对色素的稳定性研究较少。

本实验以黑米为原料,除了利用响应面法优化黑米色素的提取工艺,还对色素的稳定性做了相应的研究,旨在为黑米色素在食品工业中的综合应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑米(购于京东商城) 产自辽宁朝阳;无水乙醇、柠檬酸、过氧化氢 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

XL-16B粉碎机 广州旭朗机械设备有限公司;FA2204C分析天平 上海精密科学仪器有限公司;HH-8数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;LD5-2A高速离心机 北京雷勃尔医疗器械有限公司;2100型可见分光光度计 尤尼科仪器有限公司;ST3100型pH计 奥豪斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑米色素提取工艺 去除黑米中的杂质,用粉碎机将黑米磨成粉,过60目筛。称取适量黑米粉置于锥形瓶中,按照一定的料液比加入一定体积分数的乙醇,用0.1 mol/L的柠檬酸调悬浮液pH至3,在一定温度下恒温浸提一定时间后,取上清液于4000 r/min离心20 min,取上清定容至100 mL,即得黑米色素提取液,并在510 nm处测定提取液的吸光值。由于提取液的吸光值与黑米色素的提取率正相关,故本研究根据吸光值的大小来判断黑米色素提取率的相关高低[11-12]。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 料液比对黑米色素提取的影响 分别称取2 g黑米粉放在150 mL的锥形瓶中,以40%乙醇作为提取剂,料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL,用0.1 mol/L的柠檬酸调pH至3,在40 ℃恒温水浴条件下,浸提60 min。其它操作同1.2.1,确定合适的料液比。

1.2.2.2 乙醇体积分数对黑米色素提取液的吸光度的影响 分别称取2 g黑米粉放在150 mL锥形瓶中,料液比为1∶30 g/mL,乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%,用0.1 mol/L的柠檬酸调pH至3,,在40 ℃恒温水浴条件下,浸提60 min。其它操作同1.2.1,确定合适的乙醇体积分数。

1.2.2.3 浸提温度对黑米色素提取液的吸光度的影响 分别称取2 g黑米粉放在150 mL锥形瓶中,料液比为1∶30 g/mL,乙醇体积分数为40%,用0.1 mol/L的柠檬酸调pH至3,分别在60、70、80、90、100 ℃恒温水浴条件下,浸提60 min。其它操作同1.2.1,确定合适的浸提温度。

1.2.2.4 浸提时间对黑米色素提取液的吸光度的影响 分别称取2 g黑米粉放在150 mL锥形瓶中,料液比为1∶30 g/mL,乙醇体积分数为40%,用0.1 mol/L的柠檬酸调pH至3,以玻璃塞封口,40 ℃恒温水浴,浸提时间分别为60、90、120、150、180 min,其它操作同1.2.1,确定合适的浸提时间。

1.2.3 响应面法优化提取工艺 根据单因素试验结果利用 Design Expert 8.0.6软件中的 Box-Behnken设计原理,以浸提液的吸光度为响应值,设计响应面实验4因素3水平,见表1。

表1 响应面实验因素水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.2.4 不同条件对黑米色素稳定性的影响

1.2.4.1 温度对黑米色素稳定性的影响 各取10 mL黑米色素提取液于5支具塞比色管中,编号,将5支具塞比色管分别置于60、70、80、90、100 ℃恒温水浴30 min,然后取出,降温至室温,在510 nm处测定其吸光值。

1.2.4.2 pH对黑米色素稳定性的影响 各取10 mL黑米色素浸提液,用0.1 moL/L的柠檬酸分别将其pH调至2、3、4、5、6,然后分别将其装入已经编号的5支具塞比色管中,在510 nm处测定吸光值。

1.2.4.3 光照对黑米色素稳定性的影响 各取10 mL黑米色素浸提液于5支具塞比色管中,编号,将5支具塞比色管分别于自然光下光照2、4、6、8、10 h后,在510 nm处测定吸光值。

1.2.4.4 氧化剂对黑米色素稳定性的影响 各取10 mL黑米色素浸提液于5支具塞比色管中,编号,分别在5支具塞比色管中加入2 mL蒸馏水、分别加入质量分数为0%、5%、10%、15%、20%的过氧化氢,放置30 min后,在510 nm处测定吸光值。

1.3 数据处理

本实验采用GraphPad Prism数据处理系统作图并进行统计学分析,所有数据以均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对黑米色素提取液吸光值的影响 由图1可以看出,当料液比小于1∶30 g/mL时，黑米色素浸提液的吸光值随料液比的增加而增大,当料液比达到1∶30 g/mL时,提取液的吸光值最高,之后随着料液比的增大,提取液的吸光值逐渐减小。当料液比较低时,黑米色素吸光值低,不利于工业上提取黑米色素,当料液比过高时，不仅不利于工业上黑米色素的提取,而且造成了浸提溶剂、黑米原料、能源等的巨大浪费,带来经济上的损失,而且给后续黑米色素的浓缩纯化带来困难,不利于黑米色素的生产利用。因此,较适宜的料液比为1∶30 g/mL。

图1 料液比对黑米色素吸光值的影响Fig.1 Material to solvent effect on extraction absorbance of black rice pigment

2.1.2 乙醇体积分数对黑米色素提取液吸光值的影响 由图2可以看出,随着乙醇体积分数的增大,浸提液的吸光值逐渐增大,在乙醇体积分数为40%时,浸提液的吸光值达到最大值,之后随着乙醇体积分数继续增大,浸提液的吸光值却降低。可能是由于过高的乙醇体积分数破坏了色素,导致浸提液吸光值下降。因此,较适宜的的乙醇体积分数为40%。

图2 乙醇体积分数对黑米色素吸光值的影响Fig.2 Effect of volume fraction on the extraction absorbance of black rice pigment

2.1.3 浸提温度对黑米色素提取液吸光值的影响 由图3可以看出,从60～70 ℃浸提液的吸光值略有降低,从70 ℃开始浸提液的吸光值逐渐增加,在90 ℃时达到最大值,此后,随着温度的升高,黑米色素浸提液的吸光值骤然下降。这是因为黑米色素耐热性较差,过高的温度破坏了黑米色素的结构,导致浸提液的吸光值降低,而且过高的温度造成了能源的浪费,因此,适宜的浸提温度为90 ℃。

图3 浸提温度对黑米色素吸光值的影响Fig.3 Effect of temperature on the extraction absorbance of pigment from black rice

2.1.4 浸提时间对黑米色素提取液吸光值的影响 由图4可以看出,随着浸提时间的延长,浸提液的吸光值增大,当浸提时间为90 min时,浸提液吸光值达到最大值,之后,随着浸提时间的延长,浸提液的吸光值减小,有可能是因为浸提温度较高,长时间的浸提破坏了黑米色素的结构,使浸提液的吸光值降低。因此,适宜的提取时间为90 min。

图4 浸提时间对黑米色素吸光值的影响Fig.4 Effect time on the extraction absorbance of pigment from black rice

2.2 响应面法分析

2.2.1 响应面试验设计与结果 在单因素实验基础上,选择料液比、乙醇体积分数、浸提温度、浸提时间为影响因素,浸提液的吸光值为响应值(Y),利用Design Expert 8.0.6软件中的 Box-Behnken设计响应面试验。试验结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 8.0.6软件,对表2 Box-Behnken分析方案及结果中的数据进行拟合,以黑米色素浸提液的吸光值Y为响应值,以料液比X1、乙醇体积分数X2、浸提温度X3、浸提时间X4为自变量,得到浸提液吸光值Y对编码自变量的二次多项式回归方程如下:

2.2.2 各因素交互作用 利用Design Expert 8.0.6 软件绘制该模型的等高线图及响应面图,如图5～图10所示,响应面及等高线图是该模型所建立的二次多项回归方程的图形表达方式,这些等高线图和响应面图可以更加直观地反映出不同变量之间的交互作用及每个自变量的不同因素水平与响应值之间的关系[13-14]。由图5可以看出,在自变量料液比和乙醇体积分数的变化区间内,该等高线的形状近似椭圆,表明料液比和乙醇体积分数的交互作用明显(p<0.01)。由图6可以看出,在自变量料液比和浸提温度的变化范围内,浸提液吸光值有极大值点,响应面的最高点同时也是等高线中最小椭圆的中心点。该等高线的形状近似椭圆,表明料液比和浸提温度的交互作用明显(p<0.01)。由图7可以看出，响应面的最高点同时也是等高线中最小椭圆的中心点。该等高线的形状近似椭圆,表明料液比和浸提时间的交互作用明显(p<0.01)。由图8可以看出,响应面的最高点同时也是等高线中最小椭圆的中心点。该等高线的形状近似椭圆,表明乙醇体积分数和浸提温度的交互作用明显(p<0.01)。由图9可以看出,响应面的最高点同时也是等高线中最小椭圆的中心点。该等高线的形状近似椭圆,表明乙醇体积分数和浸提时间的交互作用明显(p<0.01)。当由图10可以看出,响应面的最高点同时也是等高线中最小椭圆的中心点。该等高线的形状近似圆形,表明浸提温度浸提和时间的交互作用不显著。

图5 料液比与乙醇体积分数交互作用 对黑米色素吸光值的影响Fig.5 Effects of the interaction of liquid ratio and ethanol volume fraction on the extraction absorbance of black rice pigment

图6 料液比与浸提温度交互作用 对黑米色素吸光值的影响Fig.6 Effects of the interaction of liquid ratio and extraction temperature on the extraction absorbance of black rice pigment

图7 料液比于浸提时间交互作用 对黑米色素吸光值的影响Fig.7 Effects of the interaction of liquid and liquid on the extraction absorbance of black rice pigment

图8 乙醇体积分数与浸提温度交互作用 对黑米色素吸光值的影响Fig.8 Effects of the interaction of ethanol volume fraction and extraction temperature on the extraction absorbance of black rice pigment

图9 乙醇体积分数与浸提时间交互作用 对黑米色素吸光值的影响Fig.9 Effects of the interaction of ethanol volume fraction and extraction time on the extraction absorbance of black rice pigment

图10 浸提温度与浸提时间的 交互作用对黑米色素吸光值的影响Fig.10 Effects of the interaction between the extraction temperature and the extraction time on the extraction absorbance of black rice pigment

2.2.3 黑米色素提取工艺最优条件的得出与验证性实验 利用Design Expert 8.0.6软件分析得到的浸提液吸光值Y对编码自变量的二次多项式回归方程，求得黑米色素浸提工艺的最佳工艺条件为:料液比1∶30.47 g/mL、乙醇体积分数43.58%、浸提温度90.44 ℃、浸提时间104.37 min,此时黑米色素浸提液吸光值的理论值为1.044。结合实验室实际操作中能够达到的条件,将最佳工艺条件修改为:料液比1∶30.5 g/mL、乙醇体积分数44%、浸提温度90 ℃、浸提时间104 min。

利用修正后的最佳工艺条件浸提黑米色素,以验证该模型预测实际实验的准确性,重复实验3次,黑米色素浸提液吸光值为(1.040±0.0086),利用统计学t检验分析得出,模型理论值与实验实际值差异不显著,表明该模型能够很好的预测实验实际值。

2.3 不同条件对黑米色素稳定性的影响

2.3.1 温度对黑米色素稳定性的影响 根据图11,随着温度的升高,黑米色素有所升高,但是升高的幅度不大,吸光值的变化范围较小。因此,可知黑米色素在90 ℃以下的温度范围内较稳定,超过90 ℃黑米色素浸提液的吸光值降低,表明高温对黑米色素有破坏作用。

图11 温度对黑米色素稳定性的影响Fig.11 Effect of temperature on the stability of black rice pigment

2.3.2 pH对黑米色素稳定性的影响 根据图12,随着pH的增大,黑米色素溶液吸光值逐渐减小,部分黑米色素分解为其他物质,不过吸光值变化很小。可知黑米色素在pH为2～6的酸性环境中较稳定,因此黑米色素适宜用作酸性食品的着色剂。

图12 pH对黑米色素稳定性的影响Fig.12 Effect of pH on the stability of black rice pigment

2.3.3 光照时间对黑米色素稳定性的影响 根据图13,光照时间对黑米色素的吸光值影响不大,变化不明显,因此,黑米色素在储存过程中不需要避光保存,黑米色素的这一特性为黑米色素的提取、储存、运输带来极大的方便。

图13 光照时间对黑米色素稳定性的影响Fig.13 Effect of light on the stability of black rice pigment

2.3.4 氧化剂浓度对黑米色素稳定性的影响 根据图14,可知黑米色素浸提液的吸光值随着所加入的过氧化氢,的乙醇体积分数的增大而减小,说明氧化剂过氧化氢对黑米色素具有破坏作用。因此,黑米色素不能应用于含有氧化性成分的食品中,在储存运输的过程中也要尽量避免与氧化剂接触。

图14 氧化剂浓度对黑米色素稳定性的影响Fig.14 Effect of antioxidants on the stability of black rice pigment

4 结论

根据Box-Behnken组合实验设计原理及响应面法可知,各因素对黑米色素吸光值的影响各不同,最佳提取工艺为:料液比1∶30.5 g/mL、乙醇体积分数44%、温度90 ℃、时间104 min。这时黑米色素的吸光值为(1.040±0.0086)。并进一步进行了验证实验,表明该模型能够很好的预测实际实验值,模型准确可靠。黑米色素在90 ℃以下的温度范围内较稳定,在酸性环境中稳定,对光照稳定,但是黑米色素稳定性受氧化剂影响较大,随着所添加过氧化氢浓度的增加,浸提液吸光值在减小,即黑米色素对氧化剂过氧化氢不稳定。因此黑色色素在具体应用中应在低温、酸性条件下进行,可以不避光保存,但在储运过程中要避免其与氧化剂接触，这为黑米色素的提取及应用提供了理论参考。

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