酶解鸢乌贼组织蛋白 制备酸溶性肽的工艺优化

潘进权,周鲜娇,刘玉婷

(岭南师范学院生命科学与技术学院,广东湛江 524048)

鸢乌贼(Symplectoteuthisoualaniensis)是我国南海海域广泛分布的一种大型可食性鱼类,其资源相当丰富,每年的捕捞量都高达200万t左右[1-2]。检测分析发现,鸢乌贼是一种营养价值较高的食材,属于典型的低脂高蛋白海产品，其氨基酸组成较合理,人体所需的8种必需氨基酸含量丰富[3-4]。此外,鸢乌贼脂肪含量低,内脏及机体骨架结构较简单,是一种具有良好加工性能的食品原材料，但由于鸢乌贼肌肉组织较致密,肉质较硬,直接加工食用口感较差[5],因此不太被大众所接受,这导致其市场售价偏低,销售受阻;国内大部分的鸢乌贼都是经粗加工制成鱿鱼丝出售,由于产品加工层次较低,导致鸢乌贼资源的利用率不高。因此开展鸢乌贼资源的深加工利用,提高其经济效益已是当务之急。

酸溶性肽是蛋白原料经酶解后得到的具有可溶于酸性环境的小肽混合物,其分子量小,具有很好的分散性,食品加工性能优良,通常被作为原料广泛应用于各类食品的加工[6-8];此外,蛋白质经酶解得到的小肽,由于经过了体外蛋白酶的预消化,进入体内后具有非常高的吸收利用率[9-12],在医用食品中得到广泛的应用[13];另外,小肽通常赋有一定的生理保健功能[14-17],在功能食品领域已被作为一种重要的功能因子被广泛应用[18-22]。鸢乌贼是优良的食品蛋白原料,然而国内外对其加工利用的相关研究报道却极少,仅有个别学者开展了鸢乌贼源抗氧化肽的相关研究,主要分析了鸢乌贼水解所得多肽的抗氧化效果[23-25],但对多肽生产工艺的研究却较少。为有效利用鸢乌贼蛋白资源,本研究考察了酶解鸢乌贼组织蛋白制备酸溶性肽的工艺路线,比较了不同蛋白酶对鸢乌贼组织蛋白的水解性能,并对酶解工艺条件进行了优化,其结果将为鸢乌贼酸溶性肽的加工与利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸢乌贼 购于水产品市场;胰蛋白酶(227.2 U/mg)、木瓜蛋白酶(126.1 U/mg)、胃蛋白酶(95.4 U/mg)、微生物中性蛋白酶(158.2 U/mg)、微生物碱性蛋白酶(224 U/mg) 国药集团化学试剂有限公司;所用其它试剂 均为分析纯。

AUY120电子分析天平 日本SHIMADZU CORPORATION公司;723N可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;SKD-600自动凯氏定氮仪、SKD-08S2红外智能消化炉 上海市沛欧分析仪器有限公司;B-260恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂;Sigma 3-18K高速冷冻离心机 博劢行仪器有限公司;DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白酶酶活测定 采用Folin-酚法[26]:1.5 mL离心管中加入0.3 mL稀释的粗酶液及0.3 mL 1.5%酪蛋白(用适宜的缓冲液配制),40 ℃反应10 min,加0.6 mL 0.4 mo1/L 的三氯乙酸终止反应,静置15 min后，14000×g离心10 min,取上清液0.6 mL,加入3 mL 0.4 mol/L碳酸钠溶液及0.6 mL福林酚试剂,于40 ℃显色20 min;按相同的操作做一试剂空白。以空白为参照，于680 nm测定样品显色液的吸光值,根据标准曲线计算酶活单位。

酶活定义:试验条件下,每分钟水解酪蛋白释放出1 μg当量酪氨酸所需酶量为1个活力单位。

1.2.2 鸢乌贼组织蛋白酶解工艺 参考文献工艺流程[27]:乌贼去除内脏取酮体肉→匀浆→称量→加水稀释→调pH→加酶水解→煮沸灭酶→离心取上清→得到水解液。

将鸢乌贼去除内脏后切成小块,称量一定量的酮体肉,按酮体肉∶水=1∶1的质量比混合,用高速组织捣碎机10000 r/min匀浆;用凯氏定氮仪测定肉浆的蛋白质含量(为6.813%);加入适量的水使肉浆的蛋白质含量达到3%,并调节其pH到8.5;将肉浆液预热到50 ℃,按照每克组织蛋白加入2500 U的蛋白酶,然后保温酶解5 h;水解结束后,将酶解液加热煮沸并维持10 min灭酶;冷却后于5000 r/min离心10 min,收集上清即得到水解液。此为酶解工艺的基本方法,后续条件优化在此基础上开展。

1.2.3 蛋白酶的选择 在参考所选酶的最适水解条件[28]和预实验的基础上,选用五种酶在其最适pH条件下进行实验,其中胃蛋白酶pH为2.0,木瓜蛋白酶pH为7.0,胰蛋白酶pH为8.5,微生物中性蛋白酶pH7.5,微生物碱性蛋白酶9.5;控制其他条件相同:底物浓度为3%,加酶量为3000 U/g,酶解温度为40 ℃,酶解时间为5 h;按1.2.2方法进行酶解试验,比较了不同蛋白酶对鸢乌贼组织蛋白水解效率的差异。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 pH对胰蛋白酶水解鸢乌贼组织蛋白的影响 按照1.2.2所述方法,分别在pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5条件下进行酶解试验,研究pH对水解液中酸溶性肽得率的影响。

1.2.4.2 酶解温度对胰蛋白酶水解鸢乌贼组织蛋白的影响 按照1.2.2所述方法,分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃条件下进行酶解试验,研究温度对水解液中酸溶性肽得率的影响。

1.2.4.3 加酶量对胰蛋白酶水解鸢乌贼组织蛋白的影响 按照1.2.2所述方法,加酶量分别为500、1000、2000、3000、4000、5000、6000 U/g条件下进行酶解试验,考察了加酶量对水解液中酸溶性肽得率的影响。

1.2.4.4 底物浓度对胰蛋白酶水解鸢乌贼组织蛋白的影响 按照1.2.2所述方法,底物浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%的条件下进行酶解试验,研究了底物浓度对水解液中酸溶性肽得率的影响。

1.2.4.5 酶解时间对胰蛋白酶水解鸢乌贼组织蛋白的影响 按照1.2.2所述方法,酶解时间分别为0.5、1、2、3、4、5、6、7 h条件下进行酶解,考察了酶解时间对水解液中酸溶性肽得率的影响。

1.2.5 响应面实验 采用响应面分析法中的Box-Behnken试验设计,对加酶量、温度与pH三个因素做进一步考察,以确定鸢乌贼组织蛋白水解的最佳工艺条件,各因素及水平取值如表1所示。

表1 响应面试验的因素水平Table 1 Factors and levels for response surface experiments

1.2.6 蛋白水解度的测定 采用凯氏定氮法测定原水解液中(蛋白)总氮含量;

采用甲醛滴定法测定水解液中的氨基态氮含量[29];

水解度(DH)定义:蛋白质水解过程中被裂解的肽键数占给定蛋白质总肽键数的百分数。

DH(%)=(水解液中氨基态氮含量/水解液中原蛋白总氮含量)×100

1.2.7 酸溶性肽含量的检测及得率计算 水解液中多肽含量的测定采用酸溶性蛋白测定方法[30]:取水解液5 mL,加入浓度2 mol/L的三氯乙酸5 mL,充分混匀后静置10 min，然后于8000 r/min离心10 min,收集上清液;采用凯氏定氮法测定上清液中氮含量。水解液中酸溶性肽得率计算:

酸溶性肽得率(%)=水解液中酸溶性肽氮含量/原酶解液中总氮含量×100

1.2.8 酸溶性肽氨基酸组成分析 参照国标方法检测[31]。采用优化后的酶解工艺制备水解液,取5 mL水解液加入浓度为2 mol/L的三氯乙酸5 mL,充分混匀后静置10 min，然后于8000 r/min离心10 min,收集得到上清液;取一定量上清液经酸水解后，利用氨基酸自动分析仪测定样液中各氨基酸的含量。

1.3 数据处理

采用PASW Statistics 18.0统计软件进行单因素实验数据分析及作图;采用Design-Expert V10.0.3软件进行响应面实验设计及相关数据分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的选择

比较不同蛋白酶对鸢乌贼组织蛋白的水解效果,结果如表2所示。

表2 不同蛋白酶对鸢乌贼组织蛋白水解效果的比较Table 2 Comparison on the hydrolysis of protein from Symlectoteuthis oualaniensis with different proteases

由表2可知,除了木瓜蛋白酶与微生物中性蛋白酶之间无显著性差异外,其它几种蛋白酶之间均表现出显著性差异(p<0.05);其中,胰蛋白酶与微生物碱性蛋白酶对鸢乌贼组织蛋白的水解能力较强,初步说明这两种蛋白酶的肽键选择性[32]与鸢乌贼组织蛋白的氨基酸组成及分布有较好的对应关系;胃蛋白酶对鸢乌贼组织蛋白的水解能力最差,这与胃蛋白酶不同的肽键选择性有直接关系[32]。此外,在强酸性条件下鸢乌贼组织蛋白的不溶[4]也是导致胃蛋白酶水解性能差的原因之一。另外,从表中结果还发现,微生物碱性蛋白酶与胰蛋白酶对鸢乌贼组织蛋白的水解特点略有不同,微生物碱性蛋白酶所得水解液的水解度是最高的,然而其多肽得率却显著低于胰蛋白酶(p<0.05),这说明微生物碱性蛋白酶在鸢乌贼组织蛋白的肽链上有相对更多的酶切位点，而胰蛋白酶在鸢乌贼组织蛋白肽链上的酶切位点相对略少,但是位点分布较均匀,因此水解液中肽得率相对较高。鉴于本研究的目的是以获得酸溶性肽为主,因此选取了胰蛋白酶做后续的研究。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 pH对鸢乌贼组织蛋白水解的影响 从图1的结果来看,相对较高的pH有利于鸢乌贼组织蛋白的水解,这与胰蛋白酶最适作用pH偏碱性的特点是一致的,而且碱性条件也有助于组织蛋白的溶出,可进一步加速组织蛋白的水解;当酶解体系的pH超过9.5后,鸢乌贼组织蛋白的水解效率会下降,这应该是由于胰蛋白酶在过强的碱性条件下变性失活所导致[33]。综合以上试验结果来看,鸢乌贼组织蛋白较适宜的酶解pH在9.5左右。

图1 pH对鸢乌贼组织蛋白水解的影响Fig.1 Effect of pH on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.2.2 酶解温度对鸢乌贼组织蛋白水解的影响 由图2所示:在30～50 ℃温度范围内,酶解体系的多肽得率会随着温度的升高而升高,显示出组织蛋白的水解效率逐步上升,这是由于适当升温增加了蛋白酶的活力,并提高了组织蛋白的溶出速率;当酶解体系的温度超过60 ℃,多肽得率则随着温度的升高而下降,这应该是高温使蛋白酶变性失活所致。从图中的结果来看,鸢乌贼组织蛋白较适宜的酶解温度在50 ℃左右,与类似文献报道结果基本一致[34]。

图2 酶解温度对鸢乌贼组织蛋白水解的影响Fig.2 Effect of temperature on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.2.3 加酶量对鸢乌贼组织蛋白水解的影响 如图3所示,加酶量对酸溶性多肽的得率有较大的影响,随着酶量的增加,酶解体系的多肽得率逐渐增加;当酶量增加到4000 U/g后,酶解体系的多肽得率达到最高并趋于稳定,说明蛋白酶相对于底物浓度已基本趋于饱和。根据以上试验结果可初步确定，酶解体系的加酶量在4000 U/g左右。

图3 加酶量对鸢乌贼组织蛋白水解的影响Fig.3 Effect of enzyme amount on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.2.4 底物浓度对鸢乌贼组织蛋白水解的影响 如图4所示,底物浓度对鸢乌贼组织蛋白的水解有明显的影响:当底物蛋白浓度低于2%时,酶解体系的多肽得率较高,说明组织蛋白的水解较彻底;当底物蛋白浓度超过3%后,酶解体系的多肽得率会随着蛋白浓度的增加迅速降低,显示出组织蛋白水解不彻底。可能是由于酶解体系中小肽浓度增加，导致对蛋白酶的反馈抑制作用增强,从而导致酶解体系中有效酶活降低;另外,随着底物浓度的增加,体系的粘稠度也迅速上升,导致蛋白分子运动能力降低,从而在一定程度上降低了组织蛋白的水解效率。根据以上试验结果,并综合考虑酶解工艺的实用价值及设备利用率,最终确定酶解体系适宜的底物蛋白浓度为3%。

图4 底物浓度对鸢乌贼组织蛋白水解的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.2.5 酶解时间对鸢乌贼组织蛋白水解的影响 如图5所示。整个酶解过程可分为3个阶段:0～2 h为快速酶解期,这一阶段中鸢乌贼组织蛋白的溶出较迅速,胰蛋白酶对组织蛋白肽链上最敏感的肽键进行切割,酶解体系的多肽得率迅速上升;2～5 h为缓慢酶解期,在这一阶段由于酶解体系中底物蛋白浓度较低,组织蛋白的溶出速率下降,胰蛋白酶主要作用于大片段肽段上的次级敏感键,酶活性降低,因此酶解体系的多肽得率表现为缓慢上升;5～7 h为酶解稳定期,在这一阶段由于底物蛋白已基本消耗完全,另外由于小肽对胰蛋白酶的反馈抑制会使蛋白酶活力降低,因此酶解过程基本处于停滞,酶解体系的多肽得率维持稳定。此外,由于蛋白水解液极易被微生物污染而变质,影响其品质,因此水解时间也不宜过长。综合考虑,确定了酶解体系的水解时间为5 h。

图5 酶解时间对鸢乌贼组织蛋白水解的影响Fig.5 Effect of reaction time on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.3 酶解工艺的响应面实验结果

从单因素试验结果可以看出,上述5个因素对鸢乌贼组织蛋白水解均有较大的影响:酶解时间越长，多肽得率越高,水解越充分。但是考虑到酶解后期水解液易滋生微生物腐败,在确保水解较完全的前提下不宜再延长水解时间,可固定酶解时间为5 h;另外,单因素实验结果显示，底物蛋白浓度越低,酶解效果越好,然而考虑到酶解工艺的实用性及设备利用率,底物蛋白浓度又不宜过低,在确保相对较高多肽得率的前提下，可固定酶解体系适宜的底物蛋白浓度为3%。为此,酶解时间及底物蛋白浓度这两个因素不再参与后续的工艺优化,仅选取了pH、加酶量及温度3个因素进行了响应面优化试验。其试验设计与结果如表3所示。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Response surface design scheme and corresponding experimental results

运用Design Expert 10.0软件对表3中的试验结果进行回归分析,可以得到酸溶性肽得率(Y)相对于pH(A)、酶解温度(B)、加酶量(C)的数学模型(因素采用编码值):

Y=73.32+1.63A-4.34B+0.76C+0.70AB+0.95AC+0.52BC-3.77A2-7.55B2-2.10C2

对以上的回归模型及数据进行方差分析(如表4所示),结果显示回归模型具有非常高的显著性(p<0.01),失拟项不显著(p=0.1252>0.05),说明模型对实验结果的拟合度非常高;模型的R2达到了0.9771,说明该模型预测值可以解释97.71%的试验结果;对各因素项的分析可以看出A、B、A2、B2、C2项对鸢乌贼组织蛋白水解有极显著影响(p<0.01);对三个因素的交互作用分析可以看出,在试验设置的各因素取值范围内三因素间的交互作用不显著。

表4 响应面试验结果的方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of the experimental results of response surface design

对上述模型进行曲面拟合可得到图6～图8的响应面图,从响应面图外形可以清晰看出以上模型拟合得到的是一个典型的凸曲面,其对应的等高线图呈现向内收缩数值递增的变化趋势,其圆心为最大值,这说明在响应曲面上是存在最大响应值的。此外,三个响应面图所对应的等高线图均为椭圆形,说明温度、pH及加酶量三因素间存在一定的交互作用。利用Design Expert10.0软件优化可确定出该最大响应值为73.899%,各因素的最适取值分别是pH9.23,酶解温度52.3 ℃,加酶量为4210 U/g。

图6 酶解温度与pH对胰蛋白酶水解鸢乌贼组织蛋白的影响Fig.6 Effect of temperature and pH on the the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

图7 加酶量与pH对胰蛋白酶 水解鸢乌贼组织蛋白的影响Fig.7 Effect of enzyme amount and pH on the the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

图8 温度与加酶量对胰蛋白酶 水解鸢乌贼组织蛋白的影响Fig.8 Effect of temperature and enzyme amount on the the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

根据以上的单因素及响应面试验确定了鸢乌贼组织蛋白水解的最佳工艺条件为:蛋白浓度4%,加酶量4210 U/g蛋白,pH9.23,酶解温度52.3 ℃,酶解时间5 h。在此优化条件下进行了验证实验,5次独立实验的平均结果为(74.02%±0.41%),与预测值相一致,说明上述拟合模型具有可靠性。此外,对比文献报道可以看出,优化后的多肽得率明显高于类似文献的报道结果[35]。

2.4 酸溶性肽氨基酸组成分析

运用氨基酸自动分析仪对水解所得酸溶性肽的氨基酸组成进行了分析,结果如表5所示。鸢乌贼酮体蛋白有较高的营养价值,它含有人体所需的17种氨基酸(因检测条件限制没能检测色氨酸),8种必需氨基酸含量高,约占氨基酸总量的38%。比较酮体蛋白与水解液的氨基酸组成可以看出,经水解所得的多肽混合物基本上保持了鸢乌贼组织蛋白的氨基酸组成,未出现氨基酸缺失情况;个别氨基酸,如甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸会因为水解表现出富集效应;仅蛋氨酸在水解后有少许的损失。

表5 酸溶性肽氨基酸组成分析结果Table 5 The results of amino acid composition of the acid soluble peptides

3 结论

不同类型蛋白酶对鸢乌贼组织蛋白水解的效率有显著性差异:其中,胰蛋白酶的水解能力最强,酸溶性肽得率最高,胃蛋白酶的水解性能最差;微生物碱性蛋白酶对鸢乌贼组织蛋白也有较强的水解作用,而且其水解特点不同于胰蛋白酶。采用响应面优化法确定的鸢乌贼组织蛋白酶解工艺条件为:蛋白浓度3%,加酶量4210 U/g蛋白,pH9.23,酶解温度52.3 ℃,酶解时间5 h。在优化的工艺条件下,酸溶性肽的得率可以达到(74.02%±0.41%)。此外,氨基酸分析结果表明,经酶解得到的酸溶性肽很好地保持了鸢乌贼组织蛋白的氨基酸组成,人体所需氨基酸较齐全,8种必须氨基酸含量丰富。综合以上结果来看,采用胰蛋白酶水解鸢乌贼制备酸溶性肽的工艺具有较好可行性。