嗜热革节孢第十二家族内切葡聚糖酶的定点突变

刘娇娇 刘玉姣 王欢 刘宁 李多川

摘要：纤维素酶有广泛的应用前景，探究纤维素酶的性质及其催化作用机制有重要意义。本研究对嗜热革节孢第十二家族内切葡聚糖酶steg1基因进行定点突变，研究突变对酶活性的影响。选择位于酶催化活性通道上的6个氨基酸位点（N35、W37、Y77、W128、Y145、N168）进行突变，得到8个突变酶（N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145F、Y145A、Y145W、N168Q）。结果显示，与野生酶WT相比，所有突变酶的活性降低，其中突变酶Y77F、W128S、Y145A的Km值和kcat值都降低；N35Q的Km和kcat值都升高；W37H、Y145F、Y145W、N168Q的Km值升高，kcat值降低。WT与突变酶的最适pH值为5.0，均保持不变。突变酶Y77F、N35Q的最适温度降低到50℃，WT和其余突变酶的最适温度为55℃。突变酶Y77F和N35Q在60℃处理10 min后分别保持49.34%和22.90%的活性，WT和其余突变酶在60℃处理10 min后都失活。本研究为探究内切葡聚糖酶的催化作用机理以及分子改造奠定基础。

关键词：内切葡聚糖酶；定点突变；酶活性；酶学性质

中图分类号：S188+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）07-0055-07

Abstract Cellulase has a wide application prospect， so it is of great significance to explore the properties of cellulase and its catalytic mechanism. Site-directed mutagenesis of the steg1 gene of endoglucanase in the 12th glycoside hydrolase family of Scytalidium thermoohilium was carried out to study the effect of mutation on the enzyme activity. Six amino acid sites （N35，W37，Y77，W128，Y145，N168） located on the catalytically active channel were selected and mutated to obtain eight mutant enzymes （N35Q， W37H， Y77F， W128S， Y145F， Y145A， Y145W， N168Q）. The results showed that the activities of all mutants decreased compared with WT； the Km and kcat value of mutant Y77F， W128S and Y145A all decreased； the Km and kcat value of N35Q both increased； the Km value of W37H， Y145F， Y145W and N168Q increased and the kcat value decreased. The optimum pH of WT and mutant enzyme was 5.0， both of which remained unchanged. The optimum temperature of mutant Y77F and N35Q decreased to 50℃， and the optimum temperature of WT and other mutants was 55℃. Mutant enzyme Y77F and N35Q remained 49.34% and 22.9% activity after being treated at 60℃ for 10 minutes respectively， while WT and the rest mutants were all inactive. The research laid foundations for exploring catalytic mechanism of endoglucanase and the molecular modification.

Keywords Endoglucanase； Site-directed mutagenesis； Enzymatic activity； Enzymatic property

纤维素酶是指能水解纤维β-1，4葡萄糖苷键，将纤维素降解成纤维二糖和和葡萄糖的一组酶的总称，主要包含内切葡聚糖酶（Endo-1，4-β-glucanase，EC3.2.4，简称EG）、外切葡聚糖酶（Exo-1，4-β-glucanase，EC3.2.1.91，简称CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG）。其中内切葡聚糖酶主要作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素等[1]。通过基因工程及蛋白工程手段在分子水平上对纤维素酶基因进行合理设计改造，构建能够产生高活性、高热稳定性纤维素酶的基因工程菌，成为国内外研究的热点之一[2-5]。

利用定点突变技術改善纤维素酶活性越来越受到人们的关注[6-8]。基于不同物种来源的碳水化合物活性酶类结构域中氨基酸序列的相似性，将序列相似度高于30%的归为同一GH（glycoside hydrolases，糖苷水解酶）家族，其中GH12广泛分布于古菌、细菌、真菌三类生物中。GH12催化机制是通过糖基化酶中间物的双取代反应，它的催化过程是由两对亲核残基和酸碱残基的谷氨酸推动进行，二级结构由15条β链构成两个β面叠加在一起，形成一个紧凑弯曲的β-三明治结构，结构凹面是纤维素与酶的催化结合部位，是由18种氨基酸（F220、P146、Y145、I144、D72、W137、W37、I147、N35、M135、V74、E133、D116、M171、N168、F118、77Y、W128）组成一个凹槽结构的活性通道[9]。关于GH12的研究进展，Sandgren等[10]用定点突变得到热稳定性提高的突变株；Huang等[11]通过对酶的结构进行分析，再利用定点突变得到活性提高的突变株；Damásio等[12]对酶催化活性环上的保守位点进行删除和插入，证明了在水解底物时这些位点氨基酸功能的重要性；2016年，Calzado等[13]利用突变技术研究了酶对底物识别及特异性的分子基础。

嗜热革节孢（Scytalidium thermophilium）是一種嗜热真菌，能产生热稳定酶。本研究克隆了嗜热革节孢GH12家族内切葡聚糖酶基因steg1，通过合理选择位于第十二家族内切葡聚糖酶STEG1活性通道上的6个氨基酸位点进行突变，得到8个突变酶（N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q），并分析突变酶的最适温度、热稳定性、动力学性质的变化，为GH12进一步的分子改造奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株与质粒 嗜热革节孢（S. thermophilium）菌株，大肠杆菌（Escherichia coli）菌株，克隆载体Trans-T1，质粒pPIC9K，毕赤酵母Pichia pastoris GS115，均为本实验室保存。

1.1.2 试验试剂 Carboxymethylcellulose sodium salt购自SIGMA公司；RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒线性化试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；反转录试剂盒、PCR试剂盒购自TaKaRa公司；必克隆试剂盒购自南京爱必梦生物材料有限公司；点突变试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；限制性核酸内切酶、DNA Marker、Thermo scientific PagRuler Prestainde Protein Ladder购自北京全式金生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自杭州弗德生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 steg1基因的克隆 接种嗜热革节孢于羧甲基纤维素诱导培养基上，50℃恒温箱培养3 d后取菌丝提取总RNA，经反转录后得到cDNA。利用steg1基因序列（GenBank：AF435071.2）为模板，按照必克隆试剂盒的引物设计要求设计引物：

F：5′-GCTTACGTAGAATTCGCTTCGATCCCGACCATCCC-3′；R：5′-TTAATTCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGCCACAGGTCAGCCCTG- 3′。PCR反应条件为：94℃ 2 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，共30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。目的片段大小约700 bp，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收。

1.2.2 重组质粒的构建 用EcoRⅠ和NotⅠ对质粒pPIC9K进行双酶切，将双酶切后的pPIC9K和steg1目的基因片段进行连接获得重组质粒，然后转化大肠杆菌，进行PCR验证，将鉴定为阳性的重组质粒克隆进行测序鉴定。

1.2.3 突变质粒的构建 参照突变试剂盒引物设计要求，设计突变引物，如表1所示。

PCR反应条件为：94℃ 2 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 3.5 min，共25个循环；72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物用DMT酶处理，之后转化DMT感受态细胞，经卡那霉素抗性筛选后进行测序鉴定。

1.2.4 重组质粒的转化、筛选与鉴定 将重组质粒用PmeⅠ进行线性化酶切，电击法转化毕赤酵母。转化后涂布于MD平板上，长出单菌落后进行G418筛选，获得多拷贝数菌株，用3′AOX1、5′AOX1通用引物进行PCR验证，并进行测序鉴定。

1.2.5 重组酵母工程菌株的诱导表达及蛋白纯化 将阳性转化子的单菌落接种于BMGY培养基中，28℃、200 r/min条件下培养1 d；离心收集菌体并转入BMMY培养基中继续培养7 d，每12 h补充甲醇至终浓度1%。离心培养液，在分离的上清液中加入硫酸铵至90%饱和，4℃静置过夜，离心，沉淀透析并用HisTrap HP柱进行蛋白纯化，然后对蛋白进行SDS-PAGE电泳。

1.2.6 酶学性质测定

（1）酶活力测定：用DNS法测定内切葡聚糖酶的活性[14]。反应体系：40 μL蛋白（0.2 mg/mL）、160 μL 的底物CMC-Na（0.8%、pH=5.0）。50℃水浴锅中孵育20 min，之后加入200 μL DNS，沸水浴中煮沸10 min，冷却至室温。在540 nm波长下测定光吸收值。蛋白浓度的测定用BCA法[15]。

（2） 动力学参数测定：测定不同底物浓度（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）下的酶活力，反应体系同上。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法计算得到Km、kcat、kcat/Km。

（3）最适温度：测定不同温度（40、50、55、60、65、70、80℃）条件下的酶活力，反应体系同上。在540 nm波长下测定光吸收值。

（4）最适pH：测定不同pH值（pH=3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）条件下的酶活力。反应体系：100 μL不同 pH值的Buffer缓冲液、40 μL蛋白（0.2 mg/mL）和60 μL的 0.8%水溶CMC-Na，反应条件同上。在540 nm波长下测定光吸收值

（5）热稳定性：测定不同温度条件下酶活力的稳定性。将40 μL蛋白在不同温度条件（40、50、60、70、80℃）下温浴10 min，取出于0℃条件下放置5 min，之后加入160 μL底物CMC-Na（0.8%、pH=5.0），反应条件同上。在540 nm波长下测定光吸收值。

（6）三维结构模型及分析：将steg1的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服务器进行三维建模，用PYMOL软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 steg1基因的克隆

经总RNA提取、PCR扩增，得到约700 bp的steg1基因（图1），序列测定结果表明，STEG1成熟蛋白编码序列由711个核苷酸组成，经扩增得到的WT基因序列与GenBank注册序列同源性为99%（第232位氨基酸由Tyr变为Phe）。

2.2 野生酶及突变酶的诱导表达纯化及SDS-PAGE分析

将WT和8个突变体的工程菌株分别诱导表达，将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测。由图2看出，得到的是单一清晰条带，说明纯化后蛋白纯度较好，蛋白分子量约为27 kD，与理论大小一致。

2.3 酶性质的测定及分析

2.3.1 酶的比活力及动力学常数分析 以不同浓度的CMC-Na为底物测定野生酶和突变酶的酶活力，根据Lineweaver-Burk作图法得到Km、kcat和kcat/Km（表2）。各突变酶N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q的比活力分别为野生酶的59.68%、23.72%、58.22%、61.95%、66.45%、70.52%、62.01%、50.57%。与WT相比，突变酶的活性均有所降低。Km近似表示酶和底物亲和力的大小，Km越小，表示酶与底物的结合能力越强。kcat表示酶的催化效率，kcat越大，酶的催化效率越高，即产物的释放效率越高。与WT相比，突变酶Y77F、W128S、Y145A的Km值均降低，说明突变酶与底物的结合能力增强，kcat值都变小，推测反应后产物的释放效率降低；突变酶N35Q的Km增大，说明酶与底物的结合能力变弱，kcat增大，推测底物的释放能力增强；而W37H、Y145F、Y145W、N168Q的Km值增大，kcat值减少，酶的活性明显降低。

2.3.2 酶促反应的最适pH值 不同pH条件下，将蛋白与0.8%的底物CMC-Na在50℃条件下水浴反应，以酶活最高者为100%，计算其余条件下的相对酶活。结果（图3）显示，突变酶与野生酶的最适pH值一致，均为5.0。

2.3.3 酶促反应的最适温度 在不同温度条件下，将蛋白与pH=5.0、0.8%的CMC-Na水浴反应。结果（图4）显示，突变酶N35Q、Y77F最适温度降为50℃，野生酶与突变酶的最适温度都为55℃。

2.3.4 酶促反应的热稳定性 将蛋白在不同温度条件下保温10 min，测定剩余酶活，以最高酶活者为100%，计算相对酶活力。结果（图5）显示，突变酶N35Q、Y77F的热稳定性提高，在60℃保温10 min后分别保持22.90%、49.34%的活性，WT和其余突变酶全部失活。

2.4 三维模型对比分析

将WT氨基酸序列提交SWISS-MODEL得到WT的三维模型，该三维模型是基于灰腐质酶GH12内切葡聚糖酶的晶体结构（PDB：1uu5）建立的，相似度为99.11%。再分别建立突变酶N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q的三维结构模型。从图6看出，本研究选择的所有突变位点都位于活性通道的凹槽上。

3 讨论与结论

本研究意在寻找影响嗜热革节孢第十二家族内切葡聚糖酶活性的相关位点，通过定点突变改变活性通道凹槽内可能位点氨基酸种类，根据突变酶活性分析酶的催化作用机理。

结构方面分析，经SWISS-MODEL同源建模，与野生酶WT蛋白晶体结构相似性极高的晶体结构（PDB：1uu5）与纤维四糖反应过程中，Asn22与WT的Asn35重合，Trp24与WT的Trp37重合，Trp115和WT的Trp128重合，Tyr132和WT的Tyr145重合，Asn155和WT的Asn168重合，在与纤维四糖的反应过程中这些部位氨基酸和葡糖基之间更易形成氢键，从而可以更容易与底物结合反应，而且在反应过程中，Tyr132的-COOH及主链上的N与葡糖基的-OH之间形成的氢键距离很近，更容易结合反应[9]。Y145F酶学性质的变化可能是由于-OH的减少，Y77F酶学性质的变化可能是由于芳香环上-OH的减少、突变前后氨基酸由极性变为非极性。在纤维素的分解过程中，纤维素酶主要依靠氢键和疏水作用与纤维素结合[16]。与WT相比，突变酶N35Q、N168Q的酶学性质的变化可能是由于突变氨基酸侧链增加了-CH2，氨基酸侧链的变长可能改变了活性通道的拥挤程度，从而对催化活性产生影响。W37H、W128S、Y145A酶学性质的变化可能是由于芳香环的缺失。芳香族氨基酸能参与形成疏水堆积表面，促进纤维长链进入催化中心[17]。Y145W酶学性质变化可能是吲哚基的增加。一些研究表明，蛋白酶熱稳定性的变化是更多数量的短螺旋和盐桥使催化活性中心带正电荷，从而使三维结构更稳定[18]，本研究中突变酶N35Q、Y77F的热稳定性提高。Srikrishnan等[19]在2011年基于结构生物信息学和进化方面进行了由Tyr到Phe的定点突变研究，结果将酶的活性提高了4倍，本研究中突变酶Y145F、Y77F的活性没有提高。Huang等[11]在2016年对第十二家族来自棘孢曲霉的内切葡聚糖酶基于进化和结构选择了Yyr到Trp的突变，研究结果显示突变酶活性是WT的104.62%，本研究中突变酶Y145W活性仅为WT的62.01%，没有达到提高的效果。

本研究克隆了嗜热革节孢GH12家族内切葡聚糖酶基因steg1，通过定点突变技术得到8种突变酶，获得了N35Q和Y77F两种热稳定性提高的突变酶，Y77F、W128S、Y145A三种Km值降低的突变酶，N35Q一种kcat值升高的突变酶。本研究为探究第十二家族内切葡聚糖酶催化作用机理提供参考，同时为寻找影响该酶活性及其他特性的位点打下基础。

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