哈萨克羊MSTN基因的DNA甲基化分析

曼则热·朱尔丁，姚力丹，包敖敦格日乐，黄李勇，依明·苏来曼，决肯·阿尼瓦什

(新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】哈萨克羊是新疆当地的粗毛羊，也是新疆原始绵羊品种之一[1]，是一个肉脂兼用品种。曾经是新疆最常见和最普遍的绵羊品种[2]。哈萨克绵羊耐寒，耐粗饲料，抗病性强，对天然牧场环境条件具有很强的适应性。目前，它已成为一个肉脂兼用型粗毛羊品种，适合在牧场放牧，具有很高的经济价值。MSTN基因对肌肉发育的抑制作用主要是抑制出生前肌肉发育和出生后肌肉的肥大生长[3]。哺乳动物DNA的甲基化与基因的表达密切相关。通常，DNA的甲基化与基因表达负相关。甲基化可抑制转录起始，但不阻止转录的延伸。这种抑制需要关键位点的甲基化，不需要完全甲基化，并且不具有启动子的甲基化值阂值[4]。对哈萨克羊的遗传育种提供新的科学依据。【前人研究进展】肌肉生长抑制素(MSTN)，也被称为GDF-8(生长分化因子8)，是指可转化生长因子β(tt-ansfot-m ink grow th factor bets TGF-β)超家族，并且是在体内广泛表达的糖蛋白质[5]。McPherron[6]等基因敲除用于研究小鼠MSTN基因，结果表明，突变体纯合子比杂合体和野生型重30%，并且肌肉质量比野生型大2～3倍。MSTN基因的缺失将导致小鼠的紧凑肌肉发生突变。虽然已经发现肌肉生长抑制素主要存在于骨骼肌中，但它也存在于脂肪组织中，并负责调节脂肪前体细胞的分化[7]。McPherron等[6]发现，肌肉生长抑制素敲除的肌肉在6个月龄后没有增加体重；而在敲除肌肉生长抑制素的小鼠和野生型大鼠的9～10月龄具有相同的体重。这可能是由于肌肉生长抑制素敲除小鼠的脂肪沉积效率下降。过量的肌肉生长抑制素分泌导致肌肉萎缩和脂肪分解增加，而肌肉生长抑制素的缺少导致肌肉和脂肪减少[7]。在脊椎动物中，DNA的甲基化以DNA甲基转移酶(DNMT)的合成为特征，并且甲基在第5个碳原子5'-CpG-3'处合成。次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(HPRT)启动子中三个特定CpG位点的甲基化对于转录抑制是具有重要意义，启动子中其他CpG位点的去甲基化不影响该基因的转录抑制[4]。【本研究切入点】目前虽然对MSTN基因的研究有一定的进展，但MSTN基因的DNA甲基化的相关文献还未见报道。研究以新疆地方绵羊品种哈萨克羊为研究对象，探索MSTN基因在其肌肉中的DNA甲基化水平，为MSTN基因在肌肉中的DNA甲基化水平提供科学的遗传学资料。【拟解决的关键问题】采用生物信息学分析方法，分析6月龄哈萨克羊的肌肉与脂肪组织的MSTN基因的DNA 甲基化水平，为了解哈萨克羊MSTN基因的DNA甲基化模式奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物

从新疆特克斯县的牧区中选出健康的五个6月龄的哈萨克羊。空腹24 h后称重。立即屠宰，计算了屠体重量和屠宰量。并采取股二头肌，股三头肌，半膜肌，最长肌与脂肪组织样本。

1.1.2 试剂与仪器试剂

Tris饱和酚、氯仿：异戊醇(24:1)、无水乙醇、70%乙醇、Tris碱、硼酸、胰蛋白胨、酵母提取物、嗅化乙锭(EB)、TAKARA公司的DNA methylation goold kit、IPTG、X-GAL、AMP、普通DNA纯化试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(均购自TIANGEN公司)，pMD 19-T载体试剂盒(TAKARA公司)，DH5a感受态细胞，琼脂糖、均购自新疆宝信生物。

仪器：科技有限公司TGL- 16高速台式冷冻低温离心机：湘仪试验审仪器开发有限公司，DYY一6C型电泳仪：北京市六一仪器厂，HZS-H水浴振荡器：哈尔滨市东明公司，HPX-9082 MBE数显电热培养箱：上海博讯公司，普通Biomctcrya PCR仪：北京艾思普科技有限公司，Gel Doc 2000型凝胶成像仪:美国Bio-Rad公司。

1.2 方 法

使用在线生物软件Methprimer (http:// www. urogene. org / methprimer /)筛选出MSTN基因(Gene ID:443449)启动子区域CpG岛和第1外显子，并设计BSP引物(P1,和P2)。经上海生工生物公司合成后使用灭菌超纯水处理，溶解稀释成10 μmol/L,-20 ℃保存。每个基因的引物序列。表1

表1 引物序列参数
Table 1 Primer sequence parameters

MSTN基因MSTN gene引物序列Primer sequences/(5'-3')扩增引物长度Product (bp)退火温度Annealing temp/℃P1F:TATAGTAGTGAGAAGTAGAAAAATGGAATAR: AAATAACAAACATTTCCTCAACTTTC25051.8P2F: TGGAAATAGTTTTTAATATTAGTAAAGATGR: CACTAAAACAACAATCAACAAAAT23050.9

2 结果与分析

2.1 DNA的质量检测

DNA的质量用1%琼脂糖凝胶检测。使用微量滴定板读数器，使用两微升来确定纯度和浓度。光度比(OD260 / OD280)为1.8～2.0。DNA纯度证明是有效的，显示了清晰的DNA条带，没有杂质和其他污染物，表明DNA质量好可以做后续试验。图1

2.2 普通PCR扩增目的基因

使用亚硫酸氢盐修饰的DNA进行BSP扩增产物和使用引物P1，P2的PCR阳性克隆的产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并使用Gel Doc 2000凝胶成像仪进行显像，研究表明，目的基因PCR扩增P1,P2片段分别为250 bp，230 bp左右(参照Mark为2000)，左(BSP产物)，右(PCR阳性克隆的产物)，扩增长度大小相同，引物可靠，可以继续后续的试验。图2

2.3 DNA甲基化模式分析与序列比对

对哈萨克绵羊不同组织中MSTN基因启动子区域的部分片段和外显子进行DNA甲基化分析。根据亚硫酸氢盐检测的原理，未甲基化的胞嘧啶被修饰为尿嘧啶，而没有甲基化。基于突变原理，分析哈萨克羊各种组织的DNA甲基化模型。序列比对结果显示总共有15个CpG位点。图3

注：1.股二头肌;2.股三头肌;3.半膜肌;4.半腱肌;5.背最长肌;6.脂肪组织;7. 股二头肌;8. 背最长肌.

Note：1.Biceps femoris; 2. tricepsfemoris; 3. semimembrane muscle; 4. semitendinosus muscle; 5. longissimusdorsi muscle; 6. adipose tissue; 7. bicepsfemoris; 8. longissimusdorsi

图1 DNA的琼脂糖电脉检测结果
Fig.1 DNA agarose detection results

注：A为P1引物的BSP扩增图，B为P1引物的PCR阳性克隆的产物，C为P2引物的BSP扩增图，D为P2引物的PCR阳性克隆的产物

Note: A is the BSP amplification of the P1 primer, B is the product of the PCR-positive clone of the P1 primer, C is the BSP amplification of the P2 primer, and D is the product of the PCR-positive clone of the P2 primer

图2 MSTN基因PCR扩增结果
Fig.2 PCR gene MSTN amplification results

2.4 哈萨克羊MATN基因的DNA甲基化模式分析

使用DNAMAN软件将测序结果与原始MSTN基因的DNA序列进行比较，确定目的序列，计算每个组织中甲基化的概率，并计算转化为所有非CpG转化为T的C的百分比确保硫酸脱氨成功的氢盐。研究表明，经序列比对后，计算出哈萨克绵羊各组织中甲基化的概率，黑色圆圈为表示甲基化的CpG位点，空心圆圈为表示未甲基化CpG位点。甲基化结果显示：6月龄哈萨克羊肌肉甲基化低甲基化水平，脂肪组织DNA甲基化程度最高，股二头肌，股三头肌，半膜肌，半腱肌，背最长肌和脂肪组织的DNA甲基化概率分别为34.7%，22.6%，23.3%，28%，42.6%和76.7%。图4，图5

图3 哈萨克羊MSTN基因DNA甲基化模式比对
Fig.3 DNA methylation pattern alignment of MSTN gene in Kazak sheep

图4 哈萨克羊MSTN基因的DNA甲基化测序峰
Fig.4 DNA methylation sequencing peak map of Kazak sheep MSTN gene

注:图中上到下，从左至右分别为股二头肌，股三头肌，半膜肌，半腱肌，背最长肌，脂肪组织

Note: From top to bottom in the figure, from left to right are the biceps femoris, triceps femoris, semimembranosus, semitendinosus, longissimusdorsi, adipose tissue

图5 哈萨克羊MATN基因的DNA甲基化模式
Fig.5 Analysis of DNA Methylation Patterns of MATN Gene in Kazakh Sheep

3 讨 论

在真核生物中，一个甲基把在胞嘧啶碱基第5碳上的氢取代，使胞嘧啶甲基化传 (methylation)。甲基化的胞嘧啶在DNA复制中可整合到正常DNA序列中。胞嘧啶的甲基化通常发生在CG的二核苷酸序列中。分析表明甲基化可能会降低转录效率。化学处理后可以进行去甲基化以恢复转录[9]。DNA的甲基化可以调节真核生物的转录，从而影响基因表达水平。 DNA序列在动物和植物的发育和分化过程中不发生变化，但基因表达在发育的不同阶段和不同组织中具有特定的模式。 DNA甲基化和这些与发育有关的基因的时空表达特征具有密切的关系。一般认为DNA甲基化与基因表达负相关，启动子区域的低甲基化可以增加转录活性，并且基因本身甲基化水平升高也可以降低基因表达水平[10]。申文雯等[11]研究表明，与常规脂肪小鼠相比，高脂饮食引起的肥胖小鼠脂肪组织的总甲基化显著增加，而高脂组中n-3 PUFAs升高。该程度显著低于n-6PUFAs组。 DNMT1，DNMT3a和DNMT3b在脂肪组织中诱导的肥胖小鼠n-6PUFAs的表达显著高于脂质食物小鼠的表达，并且这些三种酶在来自PUFA的脂肪组织n-3中的表达高于脂肪。没有改变。得出的结论是，脂肪组织的基因组DNA的甲基化程度随着肥胖而增加，鱼油n-3 PUFA影响DNA甲基化的抑制。侯林等[12]研究发现发现5-aza-cdR DNA甲基化抑制剂显著抑制DNA甲基转移酶mRNA的转录水平，并显著改善小鼠的空间学习和记忆。结果表明，DNA甲基化可能与学习和记忆能力密切相关。Xiao-Long Yuan等[13]对于180 d龄的三只雌性长白×约克夏杂交小母猪中收集三个HPO组织作为研究对象进行试验，结果显示下丘脑(H)，垂体(P)和卵巢(O)的CpG平均甲基化水平分别为57.62%，55.60%和55.44%。姚丽丹等[14]对5月龄的巴什拜羊MSTN基因的DNA甲基化进行研究结果显示：5月龄的巴什拜绵羊在股二头肌，股三头肌，半腱肌，半膜肌，背最长肌等每个肌肉组织中MSTN基因的DNA甲基化水平非常高，脂肪组织的MSTN基因的DNA甲基化水平较低，股头二肌，股头三肌，半腱肌，半膜肌，背最长肌，尾脂组织的MSTN基因DNA甲基化概率分别为74.2%、74.2%、83.2%、83.7%、82.1%和25.3%。分析巴什拜羊各组织MSTN基因表达量与DNA甲基化概率的相关性，分析可知，各组织的甲基化概率都不低，DNA甲基化概率与MSTN基因的总表达量呈显著负相关(r=-0.48，P<0.05)。与股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌表达量呈负相关，相关系数分别为：r=-0.53，r=-0.52，r=-0.54；与背最长肌和脂肪表达量呈显著负相关(r=-0.87，P<0.05；r=-0.99，P<0.05)。

研究对哈萨克羊的肌肉组织与脂肪组织MATN基因的DNA甲基化模式分析。希望对于哈萨克羊的遗传提供依据。实验中，哈萨克羊各肌肉组织中的MSTN基因的DNA甲基化情况差异不大，脂肪的甲基化概率最高，肌肉组织的甲基化概率较低。股二头肌，股三头肌，半膜肌，半腱肌，背最长肌和脂肪组织的DNA甲基化概率分别为34.7%，22.6%，23.3%，28%，42.6%和76.7%。脂肪的甲基化概率是背最长肌，股二头肌，股三头肌，半腱肌，半膜肌的甲基化概率分别为：1.8倍，2.2倍，3.39倍，2.74倍，3.29倍。其次甲基化从高到低的依次为：脂肪组织>背最长肌>股二头肌>半腱肌>半膜肌>股三头肌。且分析发现6月龄哈萨克羊各肌肉组织呈底(低)DNA甲基化水平，脂肪组织呈高DNA甲基化水平。研究结果与姚力丹等[14]研究的5月龄巴什拜羊各肌肉组织呈高DNA甲基化水平，脂肪组织呈底(低)DNA甲基化水平的结果刚好相反。根据祖玲玲[15]的对6月龄哈萨克羊的MSTN基因的表达量的研究结果结合进行分析。祖玲玲[15]的研究结果显示：脂肪组织、背最长肌、股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌的表达量分别为：3.18、5.15、5.34、4.8、5.37、4.57这与姚力丹[14]对5月龄巴什拜羊各组织MSTN基因表达量的研究结果(脂肪组织、背最长肌、股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌的表达量分别为：5.1、0.6、0.4、1.8、0.4、0.95。)也刚好相反。姚力丹[14]研究的结论为：MSTN基因DNA甲基化与其表达量呈负相关。根据这结论可以发现哈萨克羊与巴什拜羊各组织MSTN基因DNA甲基化水平的差异可能来源于各组织的MSTN基因表达量的差异。需进一步研究探讨。

4 结 论

哈萨克羊各肌肉组织中的MSTN基因的DNA甲基化情况差异不大，脂肪的甲基化概率最高，肌肉组织的甲基化概率较低。股二头肌，股三头肌，半膜肌，半腱肌，背最长肌和脂肪组织的DNA甲基化概率分别为 34.7%，22.6%，23.3%，28%，42.6%和76.7%。脂肪的甲基化概率是背最长，股二肌，股三肌，半腱肌，半膜肌的甲基化概率分别为：1.8倍，2.2倍，3.39倍，2.74倍，3.29倍。其次甲基化从高到低的依次为：脂肪组织>背最长肌>股二头肌>半腱肌>半膜肌>股三头肌。