西江流域地表水微生物污染定量源解析

张 杨,吴仁人,杨 戈,汪 光,王一舒,林凯荣,李开明,钟 杰



西江流域地表水微生物污染定量源解析

张 杨1,2,吴仁人2,3*,杨 戈4,汪 光2,3,王一舒2,3,林凯荣1*,李开明2,3,钟 杰5

(1.中山大学水资源与环境系,广东 广州 510275；2.环境保护部华南环境科学研究所,广东 广州 510530；3.广东省水与大气污染防治重点实验室,广东 广州 510530；4.肇庆市环境保护监测站,广东 肇庆 526040；5.仲恺农业工程学院环境科学与工程学院,广东 广州 510550)

水体微生物污染标记物的源强特征是定量解析微生物污染来源的关键.应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分别对人源(qHS601F/qBac725R)、牛源(BacB2-590F/Bac708Rm)、猪源(Bac41F/Bac163R)及禽类(qC160F-HU/qBac265R-HU)特异性拟杆菌引物的源强特征进行了探索,并进一步对西江流域广东段进行微生物污染来源定量解析,结果表明:针对不同目标宿主,不同特异性拟杆菌引物的源强特征为人源(qHB)>猪源(qPB)>牛源(qRB)>禽类(qCB),DNA模板浓度对引物的源强特征影响较小.选取的目标研究区域水体普遍受到人、猪、牛及禽类粪便污染.干流中qHB、qCB及qPB自上游至下游缓慢升高.各支流中qHB、qCB及qPB的平均浓度较干流均上升了1个数量级,qRB在不同河段变化较小.说明下游河段的生活污水、猪源及禽类粪便污染较为严重,牛源污染的影响较小.统计分析显示在污染水平较高的各支流中,人源特异性拟杆菌引物与传统指示菌具有一定的相关性(<0.05),说明生活污水是传统指示菌浓度较高的主要原因,且为持续排放源.

微生物污染；源强；定量；西江

潜藏于畜禽粪便及生活污水中的病原微生物是威胁人类健康的主要原因之一,我国大部分地表水均已受到不同程度的病原微生物污染[1].为有效治理水体中的微生物污染,欧美等发达国家已率先开发出了人[2]、猪[3]、牛[4]、鸡[5]等动物的宿主特异性引物,成功识别了部分地区地表水或近海水域微生物污染来源[6-7].我国研究人员也相继在部分地区筛选出适用于目标研究区域的宿主特异性拟杆菌标记[8-10],并对其实际应用的有效性进行了探索.

然而,由于特异性标记是针对不同动物肠道菌的特异性片段开发而来,因此,不同标记的源强特征也不尽相同.例如,有研究表明当致病菌浓度上升至对3%接触人群带来潜在威胁时,引物HF183的检出浓度为4200copies/100mL,而HumM2为2800copies/100mL[11].同为针对人源拟杆菌特异性片段开发出的引物,源强特征具有明显差异.

目前,我国关于微生物污染源解析技术的研究尚处于起步阶段,对宿主特异性标记的源强特征研究较少,且与现行的地表水环境质量标准(GB3838- 2002)相脱节[12],这对管理部门制定相应的标准带来了困难.本研究选取了适用于珠江三角洲地区的人及常见畜禽动物拟杆菌特异性标记,探索其对宿主粪便的源强特征.同时,以西江流域广东段为目标研究区域,定量解析了不同来源的粪源微生物在水体中的浓度水平,并探索了与传统指示菌之间的相关关系, 以期为该地区地表水微生物污染的有效控制提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器: Quanti-tray 97孔定量盘(IDEXX公司),生化培养箱(三洋公司),冷冻离心机(Sigma公司), 核酸蛋白分析仪(DU730,BeckMan Coulter公司),紫外可见分光光度计(DR2800,HACH公司),荧光定量PCR仪(LightCycler 480Ⅱ,Roche公司),多模块基因扩增仪(FlexCycler2,耶拿公司).T-Green蓝光切胶仪(TIANGEN公司).

主要试剂:COD低量程预制试剂(HACH公司),科立得试剂(IDEXX公司),HiPure Water DNA Kit (D3145-02,Magen公司), TIANamp Stool DNA Kit (DP328-02,TIANGEN公司),Talent qPCR PreMix (TIANGEN公司),琼脂糖(Biowest,电泳级),Universal DNA Purification Kit(DP214-03, TIANGEN公司), TIANprep Mini Plasmid Kit(DP103-03, TIANGEN公司).

1.2 研究区域概况

图1 西江流域采样点分布示意

选取西江流域封开城上至富湾水厂段作为目标研究区域,对其微生物污染的来源组成及污染强度进行了解析.该流域封开城上至三榕峡段沿线分布着封开县、郁南县、德庆县等人口密度相对较小的县级行政区以及人口相对较密集的云浮市城区. 该河段主要支流包括贺江、罗定江、南山河等.其中,贺江流经封开县城,由江口镇左岸汇入西江.罗定江流经罗定县、郁南县,在郁南县境内汇入西江.南山河流经云浮市城区后汇入西江.三榕峡至富湾水厂段主要经过肇庆市城区,附近人口较为密集,且养殖业数量及规模均大于上游河段. 该河段存在的主要支流为新兴江和北江支流.新兴江主要流经云浮市新兴县和肇庆市高要区,于高要区汇入西江.北江支流为西江与北江的混流通道,附近存在较多农田.具体采样点如图1所示.

1.3 样品采集

粪便样品:2017年7月~2017年9月,在珠江三角洲地区多个畜禽养殖场内采集猪、牛、鸡的粪便样品,在广州市某医院采集人粪样品.粪便样品共计40份,其中人10份,猪10份,牛10份,鸡10份.样品采集后置于冰盒中,6h内送回实验室放入-80℃冰箱中保存,留待后续处理.

水体样品:根据图1设置的采样点进行水样采集.所有样品采集后进行编号,并保存于冰盒中,6h内运抵实验室进行过滤,过滤后富集微生物的滤膜置于-80℃冰箱中,留待DNA提取.过滤方法见1.4.3.

1.4 分析方法

1.4.1 水体中理化指标的测定 COD的测定采用HACH公司低量程(LR)重铬酸钾法预制试剂.氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009).总磷采用钼酸铵分光光度法(GB 11893-1989)进行测定.总氮的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(HJ 636—2012).

1.4.2 传统指示菌的测定 传统指示菌的测定采用固定酶底物法.取100mL水样分别加入灭菌瓶中,同时加入科立得试剂进行混匀.当试剂在水样中完全溶解后,转移至97孔定量盘内,进行封口.大肠埃希氏菌的培养放入(37.0±0.2)℃生化培养箱培养,粪大肠菌群则放入(44.5±0.2)℃生化培养箱中培养,24h后进行计数.

1.4.3 DNA提取 粪便DNA提取:粪便样品DNA的提取按照TIANGEN公司DP328-02试剂盒说明书进行提取.每份粪便样品均称量0.2g.洗脱液TB均加入40μL.

水体DNA提取:采用0.22μm滤膜过滤100mL水样,使菌体留在滤膜上.并按照水体DNA提取试剂盒的说明书提取留在菌体上的DNA.DNA样品置于-20℃冰箱中保存.

1.4.4 qPCR分析 通过总细菌引物、通用拟杆菌引物、大肠埃希氏菌引物及各宿主特异性拟杆菌引物对提取的DNA进行扩增,引物序列如表1所示.qPCR扩增体系:SYBR Green Talent qPCR Premix(2×)(购自TIANGEN公司)10μL; 上、下游引物各0.8μL;DNA 模板2μL;ddH2O补足反应体系至20μL.qPCR扩增程序:①预变性,95℃,30s;②变性,95℃,5s;③退火延伸,60℃,1min.40 个循环. 扩增体系与程序参照TIANGEN公司 Talent qPCR PreMix说明书.

表1 特征生物标记引物

1.4.5 标准曲线的制作 以提取的各基因组DNA为模板,通过引物对其进行PCR扩增.纯化回收扩增后的目标产物,并与pMD 19-T Vector载体相连接,转化至DH5α感受态细胞.通过含有抗生素氨苄的固体培养基挑取阳性克隆,提取质粒DNA进行测序.基因序列提交至GenBank 进行同源性比对,结果显示(未列出),人源qHB、猪源qPB、牛源qRB、鸡源qCB特异性拟杆菌引物及通用拟杆菌引物qGB与通用引物互补的序列均为各自目标菌株不同株系的16S rRNA 基因片段,说明所选引物有较高的特异性.总细菌引物qTB中含有梭菌属、不动杆菌等其他多种菌株的核酸序列.

采用超微量分光光度计测定提取的质粒DNA浓度,并对各质粒进行10倍梯度稀释,稀释为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-77个梯度.以各梯度的DNA为模板,进行qPCR扩增,每个梯度设置3个重复.qPCR反应结束后,根据结果,采用SPSS 22软件制作标准曲线,并计算扩增效率().引物标准曲线的2均大于0.99,结果可信.扩增效率()是根据标准曲线斜率来确定的,两者符合公式=10(-1/Slope)-1.若一个反应的标准曲线斜率为-3.32,则扩增效率= 100%[10].一般认为扩增效率()在90%~110%之间是可接受的.研究中涉及的pair-t test及Pearson相关性分析也均采用SPSS 22软件进行.

2 结果与讨论

2.1 宿主特异性拟杆菌引物的源强特征分析

每份粪便样品分别称取0.2g进行DNA提取.提取过程中,为判断不同宿主粪便DNA提取效果的差异,洗脱液TB均加入40μL.提取结果如表2所示.

表2 不同宿主粪便的DNA提取效果

由于粪便中不仅含有肠道微生物,还存在消化酶、未消化的食物、胆碱、多糖等多种杂质,会降解DNA并抑制PCR反应[17].因此,保证目标DNA的提取纯度和浓度是后续实验的关键.由表2可知,不同样本提取的基因组A260/280均介于1.8~2.0之间,基因组纯度较高.然而,以等量粪便和等体积洗脱液获得的DNA浓度差异较大.其中,人粪样本的DNA浓度均值为109.91ng/μL,显著高于其它样品(< 0.05).猪粪样品中得到的DNA浓度最低(71.16ng/ μL),显著小于同为哺乳动物的人和牛(<0.05).不同动物的肠道微生物多样性及密度等因素均会影响DNA的提取浓度.已有研究表明,哺乳动物肠道内的微生物密度远高于其他物种[18].而本研究中,由牛粪和猪粪中获得的DNA浓度均小于鸡,这与王海鹰等[8]在珠江三角洲地区筛选拟杆菌引物时获取的DNA浓度结果较为相似,表明粪便DNA的提取浓度不仅与肠道微生物的密度与多样性相关,还受到其它多种因素干扰.例如,当粪便脱离宿主时,水分含量的不同也会对DNA提取浓度产生影响[19].

为排除DNA浓度对引物源强特征的干扰,分别将各目标DNA稀释至10ng/μL后进行qPCR.同时,对未作稀释处理的DNA模板进行同步扩增,用于对比DNA浓度和引物源强特征对定量源解析的影响程度.结果如图2所示.

由图2(a)可以看出,当DNA模板浓度相同时,qHB的平均浓度可达9.72Log10(copy numbers)/g,检出水平较高,说明该引物对人粪污染具有较好的灵敏性,在人源粪便污染强度较小或污染物被稀释的情况下,也能检测到相应的特异性拟杆菌片段.其次为qPB、qRB和qCB,分别较qHB下降了0.21, 0.24,2.77Log10(copy numbers)/g,说明qCB的灵敏性显著低于其它引物,若以qCB作为评价指标,可能会导致低估环境中禽类粪便的污染水平.对比未稀释至等浓度DNA模板的扩增结果可知(图2b),二者检出浓度由高至低的排序结果一致,表明不同的DNA浓度对qPCR定量结果影响较小.总体而言,拟杆菌在人、猪、牛等哺乳动物肠道中为优势菌群[20].而大多数禽类肠道中的梭状芽胞杆菌和芽孢杆菌等含量均高于拟杆菌[5].因此,哺乳动物粪便中的拟杆菌检出率明显大于禽类[8].相应地,各拟杆菌标记物的源强特征也表现为单位质量粪便下,哺乳动物拟杆菌引物的检出拷贝数普遍大于禽类拟杆菌引物.

图2 不同动物的特异性拟杆菌引物源强分析 Fig.2 Source strength analysis of specific Bacteroides primers in different animals

2.2 拟杆菌标记物的浓度水平

图3 西江流域各引物总体检出水平

应用qPCR技术对西江流域广东段干流及附近支流展开微生物污染定量源解析.流域内各引物总体检出浓度情况如图3所示.通用拟杆菌引物(qGB)在流域内的变化范围在6.09~10.15Log10(copy numbers)/100mL,平均值为7.7Log10(copy numbers)/ 100mL,检出水平显著高于特异性拟杆菌引物(<0.05),说明qGB尽管不含有特异性基因片段,不能识别微生物污染来源,但可以避免低估粪便污染水平[22].当以特异性拟杆菌引物考察流域内微生物污染源强时,污染强度依次为qHB>qCB>qPB>qRB,人源粪便即生活污水对该流域的污染较为严重.

2.3 不同来源微生物污染的分布特征

目标研究区域的干流共布设了7个采样点.由于G4~G7河段附近的城市化水平相比于G1~G4河段较高,因此在分析目标流域微生物污染时以G1~G4为目标河流的上游,G4~G7为下游.从图4(a)可以看出,干流下游的qHB、qCB、qPB和qRB的污染水平均要高于上游,平均浓度分别增加了0.41, 0.48,0.68,0.12Log10(copy numbers/100mL).已有研究表明,地表水的微生物污染强度与流域的土地开发程度、利用类型等密切相关[21,23].目标研究区域的下游段流经肇庆市主城区,城镇、居民区、养殖场较上游更为密集.因此,生活污水及养殖废水对下游各河段的影响较大.然而,尽管下游的污染水平有所升高,但相比于上游均未超出1个数量级.这是由于西江干流的流量较大,对污染物的稀释作用及水体自净能力较强,因此附近的粪便排放源未对干流的总体水质造成影响.另一方面,拟杆菌作为肠道菌[24],脱离宿主进入有氧环境后会快速衰减[6],而微生物污染排放源可能距离干流较远,在迁移的过程中发生较为明显的衰减,这在一定程度上也影响了拟杆菌的检出率及检出水平.

进一步对各支流的微生物污染进行分析,结果如图4(b)所示.各支流的微生物污染也主要以人源为主,其次为禽类、猪源和牛源.与干流相比,支流中qHB、qCB及qPB的平均浓度明显上升1个数量级,qRB也高出0.5个数量级,说明粪便排放源主要位于各支流附近.同时,各引物在不同支流的波动范围较干流也更大,qHB、qCB、qPB、qRB的检出范围分别在6.73~9.55,6.81~8.25,3.64~7.37,3.80~ 5.56Log10(copy numbers/100mL),表明各支流的微生物污染特征差异明显.再结合各支流采样点周边的环境特征可以看出,河流中的微生物污染源强与存在于周围的潜在污染源具有较强关联.例如,目标研究区域下游各支流采样点附近的商业区、居民区及养猪场明显多于上游.同时,下游的潜在污染源普遍距离附近河流较近,各支流水质受生活污水和养殖废水影响较大,qHB与qPB浓度明显上升,其中D2、E3和E5采样点尤为严重.值得注意的是,D2、E3采样点附近还存在污水处理厂.已有研究表明[25],经污水处理厂处理后的生活污水中仍含有大量的拟杆菌标记,尤其以人源特异性标记为主.因此当污水处理厂的排放量较大时,也会导致河流中qHB的显著升高.而E3、E5点处猪源粪便污染水平的急剧增加也是导致干流G7采样点qPB明显上升的主要原因.

图4 西江流域干流和沿线支流特异性引物浓度

在上游河段,位于G2~G3之间的罗定江(B1)流经罗定县和郁南县,在郁南县汇入西江.B2所在南山河主要接纳了云浮城区的生活污水及部分养殖废水,工业污染相对较少.B3所在悦城河也流经莫村镇、永丰镇等多个城镇,最后于悦城镇汇入西江.同时,B1、B2、B3采样点附近存在的居民区及养殖场也较A1、A2采样点更为密集.因此,B1、B2、B3受生活污水和养殖废水影响也更为严重, qPB较A1、A2增加了1个数量级,qHB与qCB也分别上升了0.11,0.28Log10(copy numbers/100mL).然而,相比于A1、A2下游的干流监测点G2,位于B1、B2、B3下游的监测点G3可能由于距离各支流采样点距离较远,其各引物浓度反而小于G2.

尽管qPCR技术可以分析水体微生物污染特征,但该方法由于缺少统一的评价标准以及对引物迁移、衰减规律的充分认识,仍存在部分缺陷.例如,对流域微生物污染水平的分析结果显示,除E3点外,各采样点qCB浓度均高于qPB,接近于qHB.结合引物源强实验结果可知,若qCB浓度较高,流域内禽类养殖污染水平应远大于其它各污染源.然而,通过实地调研发现目标研究区域仍以人为活动影响为主,且养猪场数量较多,与监测结果具有一定差异.这可能是由不同引物之间特异性的差距导致.尽管引物源强分析结果显示qCB的灵敏性相比于qPB较差,但已有研究报道qPB的特异性显著大于qCB[9].因此,不排除qCB在实际应用中出现假阳性结果.随着欧美等发达国家对微生物污染源解析技术的深入研究,研究者们已发现部分引物在验证阶段虽然灵敏度与特异性均符合要求(>80%),但在实际应用中,当样本量逐渐增加以及不同性质水体对引物源强特征的干扰,假阳性表现越来越频繁,使得部分宿主特异性引物在非目标宿主污染的水体中得到检出[19].同时,qCB也不能区分家禽及野生飞禽的污染[15],因此qCB的检出不能完全归于养殖废水的排放.此外,不同引物在环境中的衰减速率也不尽相同,这会导致不能准确定量分析各污染源的污染水平.例如,Skolova等[22]在研究人源和反刍动物拟杆菌引物在水体中的衰减规律时发现,人源拟杆菌引物BacH在第8d仍可检出,而牛源拟杆菌引物BacR在第6d已降至检测线以下.在本研究中,qPB的浓度显著小于qCB.同时,干流中G1~G6采样点qPB的检出浓度也均小于qRB,这可能是由于qPB衰减速率较快导致分析结果与流域内养殖分布的实际情况存在一定差异.因此,在应用拟杆菌特异性标记分析水体污染特征时,应预先针对目标研究区域及所选引物进行引物特性验证,分析其在不同环境条件下的迁移、衰减规律,对不同的宿主特异性引物建立相关检出标准,以便研究者们能够准确定量分析水体中微生物污染源强.

2.4 微生物标记与传统指示菌的相关性

由于拟杆菌标记对水体中DO的变化较为敏感,因此FIB与拟杆菌标记物的搭配使用是一种监测微生物污染的有效策略[26-28],可以判断出FIB浓度升高的主要贡献源及持续污染源.例如,Shane等[29]在研究指示菌的衰减规律时指出,拟杆菌标记物在环境中的衰减速率显著大于FIB,对粪便污染的指示性有时间限制.因此根据标记物与FIB的相关关系,可以判断出水体中的持续污染源[30].对照本研究中拟杆菌引物与传统指示菌的相关性分析可知,在水质较好的干流中,微生物标记与传统指示菌不具有显著的相关性(未列出).而在微生物污染水平较高的各支流中(表3),qHB与CEC、CFC相关性较好(<0.05),这与之前的文献中指出在以人源粪便污染为主的城市地表水中,人源拟杆菌特异性引物与传统指示菌具有较好的相关性报道一致[9],说明生活污水是导致西江流域各支流CEC、CFC浓度较高的主要原因.同时,可以初步判断生活污水为该流域的持续污染源.

表3 特异性拟杆菌引物与传统指示菌的相关性分析

注:表示相关系数;表示显著性,<0.05显著相关.

3 结论

3.1 各特异性拟杆菌引物针对等浓度及非等浓度DNA模板的源强特征均为qHB>qPB>qRB>qCB.引物的源强特征受DNA浓度影响较小.

3.2 在目标研究区域水体,干流中的qHB、qCB、qPB呈现出随河流流向缓慢升高的趋势.而各支流监测点中的qHB、qCB及qPB较干流均上升了1个数量级,qRB上升了0.5个数量级.下游各支流的qHB、qCB及qPB的平均浓度也均高于上游河段,而qRB略有下降,说明该流域下游水体受人源、猪源和禽类的污染强度明显高于上游,但牛源粪便污染对水质影响较小.

3.3 在污染水平较高的支流中,qHB与传统指示菌具有一定的相关性(<0.05),表明生活污水是导致传统指示菌浓度较高的主要原因,且对水体造成了持续污染.

[1] 魏源送,郑嘉熹,王光宇,等.地表水微生物溯源技术的开发和应用进展 [J]. 水资源保护, 2016,32(1):1-11.

[2] Gawler A H, Beecher J E, Brandão J, et al. Validation of host-specific Bacteriodales 16S rRNA genes as markers to determine the origin of faecal pollution in Atlantic Rim countries of the European Union [J]. Water Research, 2007,41(16):3780-3784.

[3] Mieszkin S, Furet J P, Corthier G, et al. Estimation of pig fecal contamination in a river catchment by real-time PCR using two pig-specific Bacteroidales 16S rRNA genetic markers [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2009,75(10):3045-3054.

[4] Ahmed W, Powell D, Goonetilleke A, et al. Detection and source identification of faecal pollution in non-sewered catchment by means of host-specific molecular markers [J]. Water Science & Technology A Journal of the International Association on Water Pollution Research, 2008,58(3):579-86.

[5] Lu J, Santo D J, Shanks O C. Identification of chicken-specific fecal microbial sequences using a metagenomic approach [J]. Water Research, 2007,41(16):3561-74.

[6] Harwood V J, Brownell M, Wang S, et al. Validation and field testing of library-independent microbial source tracking methods in the Gulf of Mexico [J]. Water Research, 2009,43(19):4812-4819.

[7] Oyafuso Z S, Baxter A E, Hall J E, et al. Widespread detection of human- and ruminant-origin Bacteroidales markers in subtidal waters of the Salish Sea in Washington State [J]. Journal of Water & Health, 2015,13(3):827.

[8] 王海鹰,贾乐华,吴仁人,等.特异性拟杆菌引物在珠江三角洲的适应性研究 [J]. 中国环境科学, 2014,34(8):2118-2125.

[9] 张 杨,吴仁人,张一敏,等.珠三角河网地区粪便污染源解析[J]. 中国环境科学, 2017,37(9):3446-3454.

[10] 王显贵,郭 萍,田云龙,等.利用qPCR定量检测水体中猪源拟杆菌特异性生物标记的研究 [J]. 农业环境科学学报, 2013,32(11): 2302-2308.

[11] Boehm A B, Soller J A, Shanks O C. Human-Associated Fecal Quantitative Polymerase Chain Reaction Measurements and Simulated Risk of Gastrointestinal Illness in Recreational Waters Contaminated with Raw Sewage [J]. Environmental Science & Technology Letters, 2015,2(10):270-275.

[12] 陈亚楠,王亚炜,魏源送,等.不同功能地表水体中病原微生物指示物的标准比较 [J]. 环境科学学报, 2015,35(2):337-351.

[13] Okabe S, Okayama N, Savichtcheva O, et al. Quantification of host-specific Bacteroides–Prevotella 16S rRNA genetic markers for assessment of fecal pollution in freshwater [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2007,74(4):890-901.

[14] S M, Jf Y, R J, et al. Phylogenetic analysis of Bacteroidales 16S rRNA gene sequences from human and animal effluents and assessment of ruminant faecal pollution by real-time PCR [J]. Journal of Applied Microbiology., 2010,108(3):974-984.

[15] Kobayashi A, Sano D, Hatori J, et al. Chicken- and duck-associated Bacteroides – Prevotella genetic markers for detecting fecal contamination in environmental water [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2013,97(16):7427-7437.

[16] Siefring S, Varma M, Atikovic E, et al. Improved real-time PCR assays for the detection of fecal indicator bacteria in surface waters with different instrument and reagent systems [J]. Journal of Water & Health, 2008,6(2):225-237.

[17] 赵健元,李进华.一种高效的哺乳动物粪便DNA提取通用方法 [J]. 激光生物学报, 2008,17(5):695-700.

[18] 姜海燕.肠道菌对旋毛虫存活、繁殖及蛋白表达变化影响的研究[D]. 长春:吉林大学, 2016.

[19] Harwood V J, Staley C, Badgley B D, et al. Microbial source tracking markers for detection of fecal contamination in environmental waters: relationships between pathogens and human health outcomes [J]. Fems Microbiology Reviews, 2013,38(1):1-40.

[20] 张 曦,朱昌雄,朱红惠.利用拟杆菌分子标记物对粪便污染溯源的研究进展 [J]. 微生物学报, 2011,51(7):863-868.

[21] 王江权,康 敉,郑 祥,等.海河流域典型河流粪源性指示微生物的污染特征及其时空分布 [J]. 环境科学学报, 2017,37(1):138-145.

[22] Sokolova E, ström J, Pettersson T J R, et al. Decay of Bacteroidales Genetic Markers in Relation to Traditional Fecal Indicators for Water Quality Modeling of Drinking Water Sources [J]. Environmental Science & Technology, 2012,46(2):892-900.

[23] Gotkowska-Płachta A, Gołaś I, Korzeniewska E, et al. Evaluation of the distribution of fecal indicator bacteria in a river system depending on different types of land use in the southern watershed of the Baltic Sea [J]. Environmental Science & Pollution Research, 2016,23(5): 4073-4085.

[24] Ahmed W, Yusuf R, Hasan I, et al. Quantitative PCR assay of sewage-associated Bacteroides markers to assess sewage pollution in an urban lake in Dhaka, Bangladesh [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2010,56(10):838.

[25] Kirs M, Caffaro-Filho R A, Wong M, et al. Evaluation of human- associated Bacteroides spp. and human polyomaviruses as microbial source tracking markers in Hawaii [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2016,82(22):6757-6767.

[26] Bachoon D S, Markand S, Otero E, et al. Assessment of non-point sources of fecal pollution in coastal waters of Puerto Rico and Trinidad [J]. Marine Pollution Bulletin, 2010,60(7):1117-1121.

[27] Mcquaig S, Griffith J, Harwood V J. Association of fecal indicator bacteria with human viruses and microbial source tracking markers at coastal beaches impacted by nonpoint source pollution [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2012,78(18):6423.

[28] Marti R, Mieszkin S, Solecki O, et al. Effect of oxygen and temperature on the dynamic of the dominant bacterial populations of pig manure and on the persistence of pig-associated genetic markers, assessed in river water microcosms [J]. Journal of Applied Microbiology, 2011,111(5):1159-1175.

[29] Rogers S W, Donnelly M, Peed L, et al. Decay of bacterial pathogens, fecal indicators, and real-time quantitative PCR genetic markers in manure-amended soils [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2011,77(14):4839-4848.

[30] Jenkins M W, Tiwari S, Lorente M, et al. Identifying human and livestock sources of fecal contamination in Kenya with host-specific Bacteroidales assays [J]. Water Research, 2009,43(19):4956-4966.

Quantitative source analysis of microorganism pollution in the surface water in Xijiang River Basin.

ZHANG Yang1,2, WU Ren-ren2,3*, YANG Ge4, WANG Guang2,3, WANG Yi-shu2,3, LIN Kai-rong1*, LI Kai-ming2,3, ZHONG Jie5

(1.Department of Water Resources and Environment, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China；2.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510530, China；3.The key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou 510530, China；4.Zhaoqing environmental protection monitoring station, Zhaoqing 526040, China；5.Department of Environmental Science and Engineering, Zhongkai University of Agriculture and Technology, Guangzhou 510550, China)., 2018,38(10)：3889~3896

Understanding the characteristic of source strength of the microbial gene marker is the key for quantitative analyzing the microbial contamination from different sources. In this study, the source strength of human-(qHS601F/qBac725R), porcine-(Bac41F/Bac163R), cattle-(BacB2-590F/Bac708Rm) and poultry-specific(qC160F-HU/qBac265R-HU) bacteroides primers were explored by qPCR method, and then quantitative analysis of the source and level of microbial pollution in Xijiang river in Guangdong province. The results showed that the source strength of different specific bacteroides primers was human(qHB)>porcine(qPB)>cattle(qRB)>poultry(qCB). The concentration of DNA had little effect on source strength of each primers. The selected target area was generally contaminated by human, pig, cattle and poultry feces. The concentration of human, porcine and poultry-specific primers were increased slowly from upstream to downstream in the main stream. In the tributary, the mean concentration of human-, porcine- and poultry-specific primers were increased 1-order magnitude compared to the main stream. qRB had little change in different section of the river. This suggests that the pollution of domestic sewage, porcine source and poultry excrement in the downstream was more serious. The influence of cattle source pollution was not significant. Statistic analysis showed that human-specific premier had a significant correlation with traditional fecal indicator bacteria in the tributary which had high level of fecal pollution(FIB)(<0.05). It reflected that human source was the major reason for the high concentration of FIB, and human feces was the persistent pollution source.

microbial pollution；source strength；quantitative；Xijiang river

X522

A

1000-6923(2018)10-3889-08

张 杨(1988-),男,宁夏银川人,中山大学与环境保护部华南环境科学研究所联合培养博士研究生,主要从事环境微生物研究.发表论文4篇.

2018-03-27

国家自然科学基金资助项目(41303054);中央级公益性科研院所基本科研业务专项(PM-zx703-201701-044);公益性行业科研专项资助项目(201509027);广东省自然科学基金资助项目(2015A030313850)

* 责任作者, 吴仁人, 副研究员 wurenren@scies.org; 林凯荣, 教授, linkr@mail.sysu.edu.cn