肺炎链球菌的培养及常规鉴定

王欣

【摘 要】目的：本实验选用肺炎链球菌为研究目标，为基础研究提供相对应的方法参考。方法：简述肺炎链球菌的复苏，传代，冻存的方法，绘制肺炎链球菌生长曲线，通过革兰氏染色和奥普托欣（ Optochin）实验对菌种进行鉴定。结果：经不同时间段对菌液进行计数发现，16h左右为菌液最大浓度期，Optochin实验抑菌环为22.3mm±2.1mm。结论：可根据本论文的实验步骤进行基础研究，结果可进行参考。

【关键词】肺炎链球菌；生长曲线；鉴定方法

【中图分类号】R365 【文献标志码】B 【文章编号】1005-0019（2018）10-222-01

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）属于革兰氏阳性菌，菌落类似圆球状，并持有α溶血环。其广泛分布于自然界中，为条件致病菌，是呼吸道感染的常见病原菌之一[1]。作为引起慢性支气管炎急性发作和社区获得性肺炎的主要病原菌[2]，肺炎链球菌一直是众学者研究的热点。现对其特性及生长曲线进行研究，为基础研究提供参考。

1 实验材料及相关仪器

1.1 实验菌种 肺炎链球菌菌种（购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC编号：10913）

1.2 药物与试剂 血平皿：郑州人福博赛生物技术有限公司，批号 150928-2；奥扑托新（Optochin）药敏片：5μg，6.35mm，20片，康泰生物，批号0C05；牛肉粉：北京奥勃星生物技术有限公司，批号12012； 氯化钠：天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20140510；蛋白胨：北京奥勃星生物技术有限公司，批号11001；草酸铵：天津市致远化学试剂有限公司，批号140410；结晶紫：天津市致远化学试剂有限公司，批号141002；蕃红液：天津市致远化学试剂有限公司，批号150503；胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司，批号121112。

1.4 主要仪器 SorvaⅡ ST16低温离心机（Thermo公司），4-1生物显微镜（OLYMPUS 日本）；BHC-1300ⅡA/B3型生物洁凈安全柜（苏州净化设备有限公司）；MDF-382E -80℃低温冰箱（日本三洋公司）。

2 实验方法及结果

2.1 实验试剂的配置 肺炎链球菌液体培养基的配制：

蛋白胨：1.0g；牛肉膏：0.3g；氯化钠：0.5g，以上粉末充分溶于95ml无菌水中，混匀后将PH值调至7.2-7.4左右，高压灭菌后冷却。冷却后的培养基与胎牛血清按：胎牛血清：5ml，培养基95ml比例混合，4℃保存备用。

2.2 实验内容

2.2.1 肺炎链球菌的复苏及培养 冻干粉：生物安全柜紫外消毒30min，取出肺炎链球菌菌种冻干粉，用0.5ml灭菌双蒸水稀释干粉，接种于两个血平板上，每个0.25ml，用接种环均匀涂抹整板即可。37℃恒温培养箱中常规培养

冻存管：从-80℃冰箱或液氮中取出菌种后，37℃水浴锅快速溶解后，无菌生物安全柜内取0.25ml内用接种环均匀涂抹整板即可。37℃恒温培养箱中常规培养。

2.2.2 肺炎链球菌的传代及冻存 传代：接种环取出培养成熟的一环菌，用三区划线法传代于血平板上。培养成熟的菌可放于4℃冰箱备用，但时间不可超过3天。

冻存：将活化3代的菌接种于液体培养基中，培养后4℃，6000转离心，弃上清，用甘油与胎牛血清比例为2：8的1ml混合液体混匀沉淀，储存于无菌冻存管中，冻存于-80℃冰箱或液氮。

2.2.3 肺炎链球菌CFU计数 即平板计数法。将菌液样品用无菌生理盐水进行10倍稀释，取合适的稀释度（一般5个稀释度），以涂布法接种于平板进行操作，常选取菌落数为30-300之间的平板作为菌落计数标准，每一稀释度采用三个平板菌数的平均数，经培养后，按照计数标准规定，统计平板上的菌落，即

菌落浓度（cfu/ml）=3平板菌落计数平均值×10n（n=稀释倍数）

2.2.4 肺炎链球菌生长曲线的绘制 根据肺炎链球菌自溶特性，取1环菌培养在5ml培养基中，在不同时间点的进行菌落计数，做出生长曲线，结果见图1。

由图1及表1可见，肺炎链球菌在培养到16h-18h时左右时，菌量达到峰值，而后逐渐下降，在以下实验中均选择培养时间为16-18小时左右。

2.3 肺炎链球菌菌种的鉴定

2.3.1 形态学观察 菌落：灰色，半透明，光滑，扁平小菌落，培养20h以后周围可见草绿色溶血环。

2.3.2 革兰染色法 革兰染色[3]：

涂片：用接种环从菌液中取出一环菌于载玻片中央涂成薄层即可，或先滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环从平板上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层；干燥：涂片后在室温下自然干燥；固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速移动3-4次，共约3-4秒，要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色；

染色：①初染：加草酸铵结晶紫一滴，约1分钟水洗；②媒染：滴加碘液，冲去残水，并覆盖约1分钟；③脱色：将载玻片水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20-30秒，立即用水冲净酒精；④复染：用蕃红液染1-2分钟水洗镜检：干燥后，置油镜观察，革兰氏阳性菌呈紫色

2.3.3 COptochin敏感试验 几乎所有的肺炎链球菌对奥普托欣敏感，而其他链球菌耐药。

4 讨论

肺炎链球菌感染是由肺炎链球菌入侵机体而引发的感染性疾病，包括肺炎、败血症、脑膜炎及中耳炎等[4]。肺炎链球菌作为常见致病菌，可引起多种疾病，因此大量的研究人员进行相关疾病的基础及临床研究。关于如何培养，在文献中有大量相关报道，但大多一笔带过，在实验的细节处往往不知所措。本论文作者在实验中总结经验分享给大家，希望对相关基础研究提供参考。

参考文献

[1] Cloutier MM， loughl ia GM.Chronic cough in children： A manif-estation of Airway hyperreactivity[J].1981， 67（1）： 6-12.

[2] 康悦，吴菊芳，黄海辉等.肺炎链球菌引起的社区获得性肺炎及慢支急性加重患者的临床特性分析[J].中国感染与化疗杂志2011青年优秀论文集，2011：207-210.

[3] 陈秀荣.革兰染色实验教学体会[J].中国西部科技，2014，9：115.