黄芪多糖铁制备及表征

王 佳，李进霞，孙树茂，谷 艳

(山西大同大学医学院，山西大同037009）

缺铁性贫血(IDA)是一种常见的疾病症状，是由于机体铁离子缺乏引起的营养缺乏病。其高危人群为妊娠期、哺乳期的妇女、儿童等，轻度贫血即可影响儿童智力及生长发育[1]。小儿缺铁性贫血主要由于先天储铁不足、后天摄铁量不够、铁需要量增多、铁吸收障碍及铁丢失过多等，其根源是体内铁缺乏，故补铁治疗是缺铁性贫血主要的治疗手段[2]。目前临床上主要使用硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁等作为补铁剂。这些亚铁制剂虽然铁含量高，吸收好，但副作用较大，易引发胃肠道刺激作用，造成便秘、腹泻、腹上部疼痛等消化道副作用[3]，且亚铁离子在体内蓄积易促进内源性自由基的生产，引发氧化毒性反应，导致细胞膜脂质过氧化造成细胞膜损伤[4]。出于以上原因，亚铁制剂作为补铁剂治疗缺铁性贫血，效果并不理想，故近年来国内外学者致力于研究非离子型高效低毒的新型补铁剂。多糖铁复合物作为补铁剂具有合适的配位稳定性，水溶性高，吸收率不低于亚铁制剂，对胃肠道刺激作用较少，并且当其释放铁之后，多糖亦可被吸收利用，发挥多糖的药理作用[3]。

黄芪（Astragalus），属豆科植物，是我国传统中药之一，主要产于山西、黑龙江、辽宁等地。黄芪多糖（Astragalus polysaccharide）是黄芪主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、增强机体免疫力、防衰老等作用[5]。由于黄芪多糖的免疫调节及抗氧化性，黄芪多糖与铁络合形成的黄芪多糖铁复合物可以缓减铁离子摄入引发的胃肠道不良反应以及体内铁蓄积引发的机体氧化损伤。因此，黄芪多糖铁作为一种新型高效低毒的补铁剂具有非常大的发展前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海申生仪器有限公司）；Tensor 27红外光谱仪（德国Bruker公司）；恒温水浴锅（天津先权仪器有限公司）；冷冻干燥机（上海豫康仪器有限公司）。

黄芪购于山西，由大同大学医学院李进霞副教授鉴定。柠檬酸三钠、三氯化铁、硫酸亚铁铵、盐酸羟胺、邻菲罗啉、硫酸亚铁、亚铁氰化钾等购于天津市江天化工技术有限公司。

1.2 黄芪多糖的制备

参照文献[6]:取黄芪药材薄片100 g，按照1∶20料液比加入去离子水，在100℃水浴中回流提取3次，每次提取2 h，将提取液合并，并于旋转蒸发仪中真空浓缩。浓缩液加入终浓度为70%的无水乙醇，充分搅拌后置于4℃冰箱中静置过夜，3000 r/min离心10 min，取沉淀，用乙醇反复洗涤3次后按照Sevag法除蛋白，冷冻干燥得黄芪多糖（APS）。

1.3 黄芪多糖铁复合物的制备

参照文献[6]:取黄芪多糖1 g，柠檬酸三钠0.5 g，加500 mL去离子水将二者充分混溶，缓慢逐滴加入2 mol/L三氯化铁溶液并不断搅拌，20%氢氧化钠溶液滴入使反应体系pH维持在9～10之间，当出现红棕色沉淀时，立即停止滴定，继续振荡6 h，3000 r/min离心15 min除去沉淀。上清液收集并加入终浓度为70%的无水乙醇，充分搅拌，3000 r/min下离心10 min，取沉淀，用去离子水充分溶解，置于透析袋中除盐，透析液浓缩后冷冻干燥，制得黄芪多糖铁复合物（APS-Fe(III)）。

1.4 黄芪多糖铁的铁离子鉴别反应

称取黄芪多糖及黄芪多糖铁各0.1 g，配制其水溶液（2 mg/mL）及盐酸溶液（2 mg/mL）。于上述溶液中分批次滴加硫氰酸钾，亚铁氰化钾，记录溶液的颜色变化。

1.5 含铁量测定

采用邻菲啰啉分光光度法[6]:取样品100 mg，加入1 mol/L盐酸200 mL，充分溶解后静置过夜，取上述溶液0.5 mL，依次加入10%盐酸羟胺0.5 mL，10%邻菲啰啉1.25 mL，pH 4.5的醋酸盐缓冲液2.5 mL，充分混匀，静置30 min，测其在510 nm下的吸光值。以硫酸亚铁铵为标准品，绘制标准曲线，所有测定均3次重复。

1.6 总多糖含量测定

采用硫酸苯酚分光光度法[7]:取样品400 μL，加入5%苯酚400 μL，充分混匀，加浓硫酸2.0 mL，混匀并静置，在490 nm处测其吸光值。以D-葡萄糖为标准品，绘制标准曲线，所有测定均3次重复。

1.7 红外光谱

取待测样品粉末，在烘干条件下KBr压片，采用红外光谱仪，测得4000 cm-1～400 cm-1波长范围内的吸收光谱[6]。

1.8 体外溶出度的测定

参照中国药典2010年版附录XC第二法(桨法)[8]:将黄芪多糖溶于0.1 mol/L盐酸溶液中，设定转速（100 r/min）与温度（37±2℃），每隔30 min取样3 mL于试管中，及时补充对应剂量的溶剂。2 h后将溶液pH调至6.8，与上述相同条件下操作，在此体系下4 h内取样。将所取样品溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，测定铁溶出度[6]。

2 结果与分析

2.1 铁离子鉴别反应

在黄芪多糖铁水溶液中分别滴加硫氰酸钾、亚铁氰化钾试剂，水溶液未出现颜色变化。而在黄芪多糖铁盐酸溶液中滴加硫氰酸钾、亚铁氰化钾试剂后，前者出现血红色絮状络合物（硫氰化铁），后者出现深蓝色沉淀（普鲁士蓝沉淀）。水溶液无颜色变化表明本实验制备的黄芪多糖铁中不含游离的铁离子，黄芪多糖与铁不是物理性混合，而是互相络合。盐酸溶液出现颜色变化表明强酸会使多糖与铁之间的键断开，使铁离子游离并显示出其特有的颜色反应。

2.2 铁含量及总多糖含量测定

本实验采用黄芪多糖与铁离子络合制备黄芪多糖铁复合物的制备方法[3]，多糖多羟基的结构使其能与铁络合，这是多糖铁复合得以制备的结构基础。表1比较了黄芪多糖与黄芪多糖铁的主要成分，结果显示黄芪多糖本身含铁量很低（0.23%），制备的黄芪多糖铁复合物铁含量较高，达到20.45%，经计算，黄芪多糖与多糖铁复合物的总多糖含量分别为20.72%和13.44%，表明铁络合后黄芪多糖铁的总多糖含量有所降低。

表1 黄芪多糖及黄芪多糖铁的铁含量及总多糖含量

2.3 虎杖多糖红外光谱

黄芪多糖及黄芪多糖铁的红外光谱如图1所示，与黄芪多糖相比，黄芪多糖铁也表现出多糖的典型吸收。黄芪多糖及黄芪多糖铁在3340 cm-1处有较强吸收峰，为O-H的伸缩振动，2879 cm-1处的小肩峰为C-H的伸缩振动，1616 cm-1处的吸收峰为C=O伸缩振动，1377～1236 cm-1间2组吸收峰为C-H变角振动[9]。黄芪多糖铁在651、582 cm-1处的吸收峰与FeOOH的特性吸收峰一致[6]，推测黄芪多糖铁中有类似FeOOH的结构。

图1 黄芪多糖及黄芪多糖铁的红外光谱图

2.4 多糖铁体外溶出试验

本实验体外模拟与人体胃肠消化相似的pH体系，考察黄芪多糖铁在该环境下的溶出度。图2为黄芪多糖铁在不同体系中的溶出度，黄芪多糖铁加入模拟胃液30 min后，有50.34%的铁离子溶出，60 min时86.45%的铁离子溶出，120 min时铁溶出度达到94.38%，铁离子相对释放完全。在模拟肠液的pH条件下，铁离子缓慢稳定溶出，4 h后，铁离子溶出度可达97.77%，结果显示，黄芪多糖铁在体外模拟胃肠道条件下有较好溶出度，有利于铁的吸收。

图2 黄芪多糖铁溶出度测定

3 结论

本研究以黄芪多糖及FeCl3为原料，在碱性条件下制备黄芪多糖铁复合物，铁离子鉴别实验表明黄芪多糖与铁互相络合，且强酸条件下二者之间的键断开，使铁离子游离并显示出其特有的颜色反应。邻菲啰啉分光光度法用于测定铁含量，结果显示制备的黄芪多糖铁铁含量较高，可达到20.45%，同时总多糖含量有所降低。通过红外光谱测定可知黄芪多糖铁也具有多糖的特征吸收，且与FeOOH有相近的吸收峰，推测黄芪多糖铁中有类似FeOOH的结构。在体外模拟人体胃肠消化环境实验中，黄芪多糖铁有较好溶出度，好的水溶性有利于铁的吸收。黄芪多糖本身具有多种药理活性，特别是显著的免疫调节及抗氧化性，上述2种性质使得黄芪多糖与铁络合形成的黄芪多糖铁可缓减铁离子摄入过多引发的胃肠道刺激以及体内蓄积引发的氧化毒性。因此，黄芪多糖铁作为一种新型高效低毒的补铁剂具有非常大的发展前景，有关黄芪多糖铁的生理活性后续将做进一步研究。